Le mutazioni stop (o nonsenso) introducono un segnale di stop prematuro nell’RNA messaggero di CFTR, che ha come effetto la produzione di una proteina CFTR tronca e non funzionale. Per le persone con fibrosi cistica (FC) che hanno mutazioni stop attualmente non ci sono opzioni terapeutiche approvate. A questo scopo è utile investigare nuove tecniche di terapia genica, specificamente tecniche di editing (correzione) sito-specifico di RNA, per correggere la mutazione nonsenso UGA nell’RNA messaggero del gene CFTR.
Sono stati usati due metodi di RNA editing (minixABE e RESTORE) veicolati in cellule umane, in particolare in due tipi di linee cellulari bronchiali, una con la mutazione W1282X e l’altra la mutazione G542X. Come trasportatori, sono state usate particelle lipidiche o vettori virali (ossia virus opportunamente modificati in cui viene inserita l’informazione genetica).
Lo scopo era convertire la molecola adenosina del codone UGA nella molecola inosina, che viene letta come guanosina e in questo modo converte il codone nonsenso UGA nel codone senso UGG.
Per prima cosa è stato confermato l’aumento dell’RNA messaggero del gene CFTR con i due sistemi di RNA editing, minixABE e RESTORE. Al microscopio si è osservata la presenza della proteina CFTR nelle cellule sottoposte a RNA editing e la sua localizzazione sulla membrana plasmatica. Inoltre, sono stati testati con successo i vettori virali per migliorare il meccanismo di trasporto nelle cellule bronchiali umane. Infine è stato svolto il sequenziamento genico a seguito della correzione dell’RNA con il sistema RESTORE, ed è stata confermata la presenza del codone senso UGG nell’RNA messaggero delle cellule.
Complessivamente, i risultati suggeriscono che le mutazioni stop UGA nell’mRNA di CFTR possono essere corrette tramite RNA editing. Questi risultati aprono prospettive promettenti nella correzione dei codoni stop prematuri presenti nell’RNA costituendo un approccio innovativo, anche se ancora da valutare in vivo.
L’uso di inibitori della degradazione dell’RNA mutato incrementando l’RNA da modificare può rivelarsi utile. Rimangono aspetti da ottimizzare, in particolare il meccanismo di trasporto mirato verso specifici organi.
Stop mutations cause a Premature Termination Codon (PTC) in the CFTR gene, causing a truncated non-functional CFTR protein. Researchers used RNA editing techniques to rescue the CFTR stop mutation (UGA) thus increasing the therapeutic opportunities for CF patients with stop mutations that currently have no treatment.
To recode the PTC (UGA) in a sense codon (UGG) in the CFTR mRNA they exploited two base editors to convert the PTC’s adenosine to inosine (A-to-I) thus allowing the completion of CFTR translation: the minixABE (A to I Base Editor) and RESTORE (Recruiting Endogenous ADARs to Specific Transcripts for Oligonucleotide-mediated RNA Editing).
Using the minixABE and the RESTORE tools, they used immunofluorescence to observe the recovery of the CFTR protein on the plasma membrane in CFF-16HBEge CFTR W1282X and CFTR G542X human cells. The rescue of the CFTR full transcript was also confirmed. In addition, they successfully tested the recombinant Adeno-Associated Viruses (rAAVs) in which the RNA editing tools were inserted, as a strategy to enhance the delivery in human airway cells.
Altogether the results obtained suggest that UGA stop mutations in the CFTR mRNA might be corrected by RNA editing. These findings pave the way for new and promising scenarios for the treatment of stop mutations of the CFTR gene. Also, combining RNA editing with drugs that inhibit the degradation of mRNA with PTC might be useful. However, several challenges remain, like the delivery and refinement of RNA editing techniques.
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