Il progetto si propone di identificare i possibili bersagli biologici e il meccanismo d’azione di ARN23765, un correttore di CFTR scoperto dal nostro gruppo di ricerca all’interno del progetto Task Force for Cystic Fibrosis, che ha mostrato un’elevata potenza nel ristabilire la funzione della proteina CFTR mutata in cellule epiteliali bronchiali da pazienti con la mutazione F508del/F508del. Nonostante i dimostrati effetti biologici, il meccanismo d’azione di ARN23765 non era stato ancora del tutto caratterizzato. Per studiare i bersagli biologici e il meccanismo d’azione di ARN23765 in cellule viventi, i ricercatori hanno usato un particolare approccio biochimico, noto come Photo-Affinity Labeling (PAL). Questa tecnica è basata sulla sintesi di sonde chimiche strutturalmente correlate a ARN23765. Una sonda chimica è una piccola molecola capace di legarsi in modo reversibile a un bersaglio biologico; in questo caso, le sonde sono caratterizzate anche dalla presenza di una porzione fotoreattiva (cioè che reagisce alla luce) e di un gruppo chimico capace di legarsi a un marcatore molecolare (per seguirne il percorso). Sono state così progettate e sintetizzate alcune sonde foto-attivabili che sono state poi somministrate in colture di cellule esprimenti CFTR nativa o mutata (F508del). Le cellule sono state poi esposte alla luce UV per consentire alle sonde di legarsi in maniera stabile alle biomolecole con cui interagivano. Il marcatore legato alla sonda ha consentito di rilevare e/o isolare i complessi sonda-bersaglio, e quindi ha permesso di identificare i possibili bersagli mediante tecniche sperimentali di elettroforesi di proteine su gel e/o spettrometria di massa. I dati ottenuti hanno dimostrato che le sonde foto-attivabili derivate da ARN23765 si legano a CFTR in cellule intatte, indicando che ARN23765 può ragionevolmente agire direttamente su CFTR. Questo risultato è di indubbio interesse poiché rivela per la prima volta l’interazione di un modulatore con CFTR in un ambiente biologico integro. Inoltre, tale metodologia ha permesso di identificare alcune interessanti proteine (attualmente in fase di valutazione) capaci di interagire con CFTR, che potrebbero rappresentare ulteriori bersagli di ARN23765.
The project aims to identify the biological targets and mechanism of action of ARN23765, a CFTR corrector, discovered in our research group (Task Force for Cystic Fibrosis project), with a sub-nanomolar potency in rescuing the function of mutant CFTR in human bronchial epithelial cells from F508del/F508del CF patients. Despite the validated pharmacological effects, the mechanism of action of ARN23765 has not yet been conclusively defined. To pursue this challenging goal in living cells instead of purified proteins, the researchers decided to use a biochemical approach known as Photo-Affinity Labeling (PAL). This technique entails the synthesis of chemical probes structurally related to ARN23765, characterized by the presence of a photoreactive portion and a chemical group capable of binding to a reporter molecule. These photo-affinity probes were designed, synthesized and finally incubated with living cells expressing native or mutant (F508del-) CFTR. The cells were then exposed to UV light, thus allowing probe cross-linking to bio-molecules in close proximity. The reporter molecule was used to detect and/or isolate probe-protein adducts for the identification of the possible target(s) using protein gel electrophoresis, western blot and/or mass spectrometry analysis. The data achieved so far demonstrated ARN23765-like photo-affinity probes bind to CFTR in living cells, indicating that corrector ARN23765 may reasonably act directly on CFTR. To the best of our knowledge, this outcome is of great interest since it discloses the unprecedented interaction of a modulator to CFTR in an integral biological setting. By means of this PAL technology a set of interesting proteins (currently under evaluation), involved directly or indirectly with CFTR, were also identified and could reasonably represent additional targets of ARN23765.
Abstract presentati a congressi scientifici
