All’interno del progetto Task Force for Cystic Fibrosis è stato scoperto ARN23765, un correttore di CFTR con un’elevata potenza nel recuperare la funzione della proteina mutata in cellule epiteliali bronchiali da persone con fibrosi cistica (FC) omozigoti per la mutazione F508del (cioè portatori della mutazione su entrambe le copie del gene). Per meglio caratterizzare ARN23765 e rafforzarne il profilo come candidato allo sviluppo preclinico per il trattamento della FC, il gruppo di ricerca si è proposto di identificare a livello molecolare il suo meccanismo d’azione e il sito di interazione con il suo target biologico.
Il meccanismo d’azione di ARN23765 è stato studiato in cellule integre attraverso l’approccio biochimico di Photo-Affinity Labeling (PAL), precedentemente usato nel progetto FFC#4/2020 e in grado di mostrare, nelle cellule viventi, l’interazione tra ARN23765 e il canale CFTR. Per identificare le regioni della proteina CFTR coinvolte nell’azione di ARN23765 sono stati effettuati studi computazionali e funzionali, insieme a esperimenti di mutagenesi, che consistono nell’inserire mutazioni in siti specifici del DNA di CFTR per evidenziare le sequenze essenziali alla correzione indotta da ARN23765.
Il meccanismo d’azione di ARN23765 in cellule integre è stato identificato attraverso studi di PAL usando sonde chimiche strutturalmente correlate al correttore. Inoltre, sono stati condotti studi funzionali con specifici domini di CFTR per permettere di identificare le porzioni proteiche coinvolte nella correzione indotta da ARN23765. Infatti, la proteina CFTR è composta da 5 domini: 3 nel citoplasma (NBD1, NBD2 e R domain) e due che attraversano la membrana apicale (MDS1 e MSD2). Infine, sono stati effettuate analisi computazionali insieme a esperimenti di mutagenesi per chiarire le basi molecolari dell’interazione di ARN23765 con il suo target biologico.
L’interazione di ARN23765 con CFTR è stata studiata in cellule FC con mutazione F508del-CFTR. Gli studi funzionali con i diversi domini di CFTR hanno dimostrato che l’interazione con ARN23765 coinvolge la porzione proteica tra MSD1-NBD1. Sono stati identificati i residui amminoacidici coinvolti nell’interazione tra ARN23765 e CFTR.
I risultati di questo progetto contribuiscono a chiarire le basi molecolari del recupero dell’attività di CFTR indotta da ARN23765. I dati mostrano che in cellule integre il correttore si lega direttamente a CFTR, stabilizzandola attraverso interazioni specifiche con residui amminoacidici in una regione proteica definita.
Within the Task Force for Cystic Fibrosis project, our group discovered the corrector ARN23765. To better characterize the compound and strengthen its profile as a preclinical candidate for the treatment of CF, we aimed to identify at a molecular level its mechanism of action and the site of interaction with its biological target.
ARN23765 mechanism of action was studied in intact cells through the biochemical approach of the Photo-Affinity Labeling (PAL). To identify the regions of CFTR protein involved in the action of ARN23765, computational and functional studies were carried out along with mutagenesis experiments.
ARN23765 mechanism of action in intact cells was identified through PAL studies using chemical probes structurally related to our corrector. Furthermore, functional studies with specific CFTR domains were conducted to identify the protein portions involved in the correction induced by ARN23765. Finally, computational analyses together with mutagenesis experiments were carried out to elucidate the molecular basis of the interaction of ARN23765 with its biological target.
The interaction of ARN23765 with CFTR was studied in cells derived from people with CF overexpressing F508del-CFTR. Functional studies with CFTR domains identified the protein portion involved in the correction induced by ARN23765, while the binding site and amino acid residues implicated in the interaction with CFTR were clarified through computational analyses and mutagenesis studies.
The results of this project contribute to clarifying the molecular basis of the recovery of CFTR activity induced by ARN23765. The data show that in intact cells the corrector binds directly to CFTR, stabilizing it through specific interactions with amino acid residues in a defined protein region.
