Le tecniche di correzione del DNA che si sono sviluppate e raffinate negli anni recenti aprono a prospettive di cure definitive per malattie genetiche come la fibrosi cistica (FC). Tra queste, la tecnologia CRISPR-Cas9 permette di correggere le mutazioni nel DNA con elevata efficienza e precisione.
Non tutte le mutazioni possono essere corrette con strategie standard di CRISPR-Cas9, ma esistono vie alternative come il CRISPR-base editor che è in grado di correggere le mutazioni senza tagliare il DNA, convertendo l’informazione genetica errata in quella corretta. È anche possibile sfruttare l’esistenza delle cosiddette mutazioni neutralizzanti, correzioni secondarie in grado di neutralizzare l’effetto della mutazione originale che causa la malattia.
Nel progetto, la tecnologia CRISPR-base editor è stata usata per correggere la mutazione 2789+5G>A e la mutazione F508del in cellule epiteliali bronchiali umane e organoidi intestinali derivati da persone con FC.
Le mutazioni neutralizzanti identificate precedentemente sono state inserite prima in modelli cellulari, in cui è stata valutata l’efficienza del processo di correzione e la conseguente funzionalità del canale CFTR con mutazione F508del. Successivamente è stata valutata l’efficienza della correzione in cellule bronchiali primarie.
È stata sviluppata una strategia di correzione anche per la mutazione 2789+5G>A: dopo test iniziali in linee cellulari, è stata verificata l’efficienza di correzione della mutazione sia in organoidi che in cellule bronchiali derivati da pazienti. Negli stessi modelli è stato valutato anche il ripristino della funzionalità del canale CFTR.
Entrambe le strategie, sia usando le mutazioni neutralizzanti per correggere F508del che usando i base editor per correggere la mutazione 2789+5G>A, hanno portato a un ripristino della funzionalità di CFTR nei modelli cellulari, in cellule primarie e, nel secondo caso, anche in organoidi, rivelando che i CRISPR-base editor sono una tecnica promettente per una futura cura della FC.
Grazie a questo lavoro di ricerca si è osservato che anche le mutazioni più difficili da correggere possono essere riparate con la tecnologia CRISPR-Cas9: il successo di queste strategie ora dipende dallo sviluppo di un efficace trasporto di questi sistemi a livello dei tessuti, in particolare dei polmoni delle persone con FC, al fine di raggiungere i test in clinica.
Several DNA correction strategies developed and refined over the past few years hold great promise for the definitive cure of genetic diseases such as cystic fibrosis (CF).
CRISPR-Cas9 technology allows the correction of DNA mutations with high efficiency and precision. While some mutations can be directly corrected with CRISPR-Cas9, there are mutations such as F508del that cannot be repaired with standard CRISPR-Cas9 strategies. However, that same technology can be exploited to introduce “neutralizing” mutations which can revert the effect of the F508del main mutation.
To correct the mutations the research team exploited CRISPR-base editors, advanced tools to precisely modify DNA. An alternative indirect strategy was used for F508del mutation, introducing “neutralizing” mutations which can revert the effect of F508del, while a direct correction was performed on 2789+5G>A mutation.
The previously identified neutralizing mutations have been inserted into F508del-CFTR cell lines, evaluating the editing efficiency and the rescue of CFTR channel function. Then the editing efficiency was evaluated also in primary human bronchial epithelial cells.
A correction strategy has been developed also for the 2789+5G>A mutation. After initial tests in cell lines, researchers verified the correction efficiency both in patient-derived intestinal organoids and in bronchial cells. The rescue of the CFTR function was also evaluated in these models.
It was observed that the introduction of neutralizing mutations in the CFTR gene carrying F508del mutation induces a functional rescue of CFTR protein in cellular models. Neutralizing mutations were also efficiently inserted into primary cells.
The use of base editors to correct the 2789+5G>A mutation restored the function of CFTR protein in both primary cells and organoids.
These results demonstrate that base editors are a promising strategy for future CF treatment.
This research has demonstrated that mutations, even the most difficult to correct, can be repaired with CRISPR-Cas9 technology.
The success of these strategies now depends on effective delivery to the target tissues, particularly the lungs of CF patients. to move forward with clinical testing.
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