Mediante microscopia a fluorescenza diretta e immunofluorescenza indiretta è stato mostrato che il sistema di mRNA editing REPAIRv2 è in grado, in differenti sistemi modello cellulari in vitro, di correggere le mutazioni stop anche se con un’efficienza non molto elevata. I risultati ottenuti in questo studio pilota suggeriscono comunque che REPAIRv2 promuove l’editing (correzione) di codoni stop prematuri presenti sull’mRNA del gene CFTR in cellule FRT (CFTR-W1282X) oltre che su mRNA di geni di riferimento. Inoltre, il fatto che REPAIRv2 abbia funzionato in cellule IB3.1, provenienti da pazienti affetti da fibrosi cistica, suggerisce che il sistema possa essere utile per correggere mutazioni stop di malati FC. Comunque, un miglioramento nella modalità di somministrazione del sistema riparativo e il raggiungimento di incremento/stabilizzazione dell’mRNA bersaglio appaiono necessari nell’estensione eventuale di questo progetto al fine di incrementare l’efficienza dell’editing.
Direct fluorescence microscopy and immunofluorescence analyses detecting the corrected proteins (H2BGFP and CFTR, respectively) suggest that the REPAIRv2 system was able, in different cell lines, to edit the H2BGFPopal and the CFTRW1282X mRNA. However, the rate of editing does not seem high. Indeed, when RNA was purified from transfected cell, retro-transcribed and amplified base correction was not detectable by standard DNA sequencing and western blot. Collectively, these results indicate that the REPAIRv2 tool is able to edit the UGA premature stop codon present in the HeLa-H2BGFPopal cells and in engineered FRT-W1282X cells harbouring the UGA PTC in the CFTR mRNA. Furthermore, the REPAIRv2 tool worked in the IB3.1 cells suggesting its ability to edit endogenous UGA premature stop codon. Anyway, enhance the delivery of the plasmids as well increase/stabilize the target mRNA to be edited, seem necessary to improve the efficiency of REPAIRv2.
