Scopo di questo progetto è studiare il ruolo svolto dalle pompe di efflusso (proteine di membrana) nella multi-resistenza agli antibiotici in isolati clinici di B. cepacia. Lo studio del meccanismo di resistenza, mediato da pompe di efflusso, è importante per due motivi. Primo, può spiegare la resistenza intrinseca di questi microrganismi ad un ampio spettro di antibiotici, poiché le pompe di efflusso possono prevenirne l’accumulo. Secondo, in batteri filogeneticamente affini (Pseudomonas), è stato dimostrato che mutazioni nei geni codificanti queste pompe aumentano il livello di resistenza ai farmaci. Le pompe di efflusso dei batteri sono classificate in 5 diverse famiglie, ognuna delle quali è caratterizzata da motivi consensus (sequenze di ammino acidi) specifici. In particolare, noi stiamo studiando la famiglia RND (Resistance-Nodulation-cell Division) che svolge un ruolo fondamentale nell’efflusso dei farmaci nei batteri Gram-negativi.
Approcci sperimentali e risultati ottenuti.
1. La ricerca ha permesso di identificare 14 ipotetici geni codificanti proteine di efflusso. Per verificare l’effettivo ruolo di questi geni nella resistenza agli antibiotici si sta procedendo al clonaggio di questi geni in particolari vettori e successiva trasformazione delle molecole ricombinanti in opportuni ospiti batterici.
2. Ad oggi, 5 geni sono stati amplificati. Il punto successivo riguarda la ligazione dei geni amplificati in opportuni vettori. In generale, i vettori sono molecole di DNA circolari che si replicano in particolari organismi ospiti.
3. Per i problemi sopra-descritti abbiamo valutato la stabilità plasmidica dei vettori pMLBAD, pUFR047 e pLAFR3 in B. multivorans. I risultati indicano che soltanto il plasmide pMLBAD risulta stabile.
4. Nonostante i problemi di stabilità plasmidica, abbiamo tentato di clonare i 5 geni in tutti i vettori testati e di trasformare E. coli e B. multivorans (in cui tali vettori si).
5. Data la bassa percentuale di successo del clonaggio genico abbiamo cercare di seguire due vie alternative:
– Utilizzo di una banca cosmidica di B. cepacia ATCC25416 (gentilmente fornita dal Dr. V.Venturi) e ricerca dei geni di interesse. Gli esperimenti sono in corso.
– Coniugazione triparentale della stessa banca cosmidica in B. cepacia complex e selezione su diversi antibiotici (ofloxacina, ciprofloxacian, trimetoprim, rifampicina, acido nalidixico, cloramfenicolo, meropenem, piperacillina
).
Sono stati identificati numerosi cloni resistenti, la cui analisi è in corso.
