Sono stati generati dei costrutti (minigeni) contenenti i difetti di splicing 3272-26A>G o 3849+10kbC>T. Le analisi condotte sui minigeni modello in cellule standard o in cellule epiteliali di vie respiratorie o in organoidi di pazienti FC hanno evidenziato che AsCas12a, combinato al gRNA selezionato, rappresenta un sistema efficiente per riparare i difetti di splicing. La strategia proposta per la correzione delle mutazioni di splicing 3272-26A>G o 3849+10kbC>T, basata sull’enzima AsCas12a, si è dimostrata efficace nel recupero della funzionalità di CFTR endogeno negli organoidi intestinali di paziente FC, considerati questi un valido modello preclinico ex vivo. I risultati ottenuti forniscono una base importante per lo sviluppo futuro di un approccio clinico innovativo di terapia genica per il trattamento dei difetti di splicing che causano fibrosi cistica.
A minigene-constructs was generated to efficiently model the 3272-26A>G CFTRand 3849+10kbC>T splicing defects. The analyses performed with the minigene models, either transiently or stably transfected in HEK293 cells and Caco-2 cells, in primary airway cells and in patients derived organoids, revealed that the AsCas12a in combination with a selected guide RNA is a highly efficient and precise technique to repair the splicing defects. These results demonstrate that AsCas12a in combination with a single sgRNA efficiently rescues endogenous CFTR function in patient’s intestinal organoids, which are recognised as a highly valuable preclinical model to predict ex vivo any success of therapeutic treatment in human patients. These results provide an important milestone towards the development of a successful gene therapy clinical approach for the treatment of splicing defects in Cystic Fibrosis.
