Nella libreria IRBM sono stati cercati i composti con attività read-through saggiandoli su cellule epiteliali umane con mutazioni stop. Il sistema costruito per la ricerca (basato su due proteine fluorescenti, denominate yEGFP e Cherry) è stato validato esaminando la capacità di indurre read-through da parte di aminoglicosidi, tra cui G418, e di altre molecole di cui si conosce già l’azione di correzione di mutazioni di stop. Si è proseguito con lo sviluppo di modelli di cellule contenenti codoni di stop (frammenti di DNA del gene con funzione di messaggio). Sono stati applicati i composti della libreria IRBM su queste cellule e il sistema fluorescente ha identificato un composto bioattivo su cui si continueranno gli studi. Infine sono stati sviluppati diversi steps sperimentali per la produzione di un nuovo modello cellulare (nel quale la mutazione stop è introdotta da un vettore virale) adatto ad analizzare l’efficacia del ripristino della sintesi di proteina CFTR.
(a) Development of yeast systems for the read-through screening: the researchers have constructed a novel system that consists of two sequences encoding the fluorescent proteins, yEGFP and Cherry cloned in tandem in phase or interrupted by a stop codon and optimized for the expression in yeast. Then they have evaluated the dual fluorescence system in a read-through assay in the presence of aminoglycosides G418 and several other molecules leading to read-through correction of stop codon mutations, including tobramycin. (b) Development of cellular clones transfected with lentivirus vectors with GFP carrying nonsense mutations. (c) Identification of a bioactive compound from IRBM library using GFPmut cellular clones. (d) Creation of UPF1 knock-out cellular clones for the modulation of NMD mechanism. (e) Biological assays to analyze CFTR function: they have developed experimental steps for the generation of a new model system consists of lentivirus vector combining EYFP gene reporter (for the CFTR analysis) with CFTR gene with or not stop codons and transfected in human cell line in order to analyze the restoration of CFTR protein and channel function.
