Uno dei meccanismi di difesa più efficaci del polmone contro le infezioni è il trasporto mucociliare, il quale permette di spingere fuori dai polmoni le particelle e i microbi che entrano con la respirazione e vengono intrappolati dal muco. Perché questo meccanismo funzioni bene, la superficie dell’epitelio bronchiale deve essere ottimamente idratata. Il livello d’idratazione dell’epitelio dipende dal giusto bilanciamento tra l’assorbimento e la secrezione di sali e acqua, due fenomeni controllati dall’attività di canali ionici, ossia da proteine dell’epitelio che permettono il flusso di ioni come sodio o cloruro accompagnati da acqua.
Le mutazioni del gene CFTR riducono marcatamente la funzione del canale CFTR, principale responsabile della secrezione di cloruro e acqua dall’interno all’esterno della cellula epiteliale . In queste condizioni, continua a funzionare perché a carico di un’altra proteina, il canale del sodio ENaC (Epithelial Na+ Channel), l’assorbimento di acqua e sodio all’interno della cellula e questo peggiora ulteriormente la scarsa idratazione delle vie aeree.
Ci siamo chiesti se fosse possibile ripristinare un buon livello d’idratazione delle vie aeree riducendo l’assorbimento di sodio e acqua a carico del canale ENaC. Ci sono due modi per ridurre la funzione dell’ENaC, una farmacologica e l’altra genetica. Sebbene l’approccio farmacologico sia in principio più semplice, i tentativi fatti finora non hanno prodotto i risultati sperati. Quindi, al fine di ridurre l’assorbimento di sodio e acqua abbiamo scelto una strategia genetica. Invece di farmaci, sono state utilizzate piccole molecole di RNA, chiamate siRNA (“short interfering RNA”), con la capacità di spegnere geni in maniera specifica. Noi abbiamo usato siRNA contro diverse sub unità che compongono il canale ENaC (siRNA anti-ENaC).
Lo scopo del nostro studio1 era di stabilire se il trattamento con i siRNA anti-ENaC fosse capace di ridurre l’assorbimento di fluido all’interno della cellula epiteliale e quindi aumentare lo spessore dello strato di fluido sulla superficie dell’epitelio (fluido periciliare). Per valutare l’effetto dei siRNA anti-ENaC abbiamo lavorato su epiteli ottenuti da pazienti FC con mutazione F508del, e su epiteli di soggetti non-FC come controllo.
Prima di tutto abbiamo verificato che i siRNA anti-ENaC funzionassero, valutando la funzione del canale ENaC in epiteli trattati con queste molecole. I nostri dati hanno mostrato che le molecole di siRNA-ENaC riducono efficacemente l’attività del canale ENaC, fino a un 70%. E’ importante notare che l’effetto è simile sia in epiteli FC che in epiteli non-FC, dato non sorprendente perché, come dicevamo sopra, il canale ENaC funziona ugualmente bene negli epiteli FC come in quegli non-FC. Ci siamo quindi chiesti se questa riduzione nell’attività del canale ENaC fosse sufficiente per portare ad un cambiamento significativo nel’assorbimento di fluido.
Per misurare l’assorbimento, abbiamo applicato un volume di fluido sulla superficie dell’epitelio e dopo 24 ore abbiamo controllato quanto ne rimanesse. La differenza tra volume iniziale e finale è il volume assorbito. Abbiamo fatto questi studi in epiteli non trattati e in epiteli trattati con i siRNA anti-ENaC, dimostrando che i siRNA anti-ENaC portano a una riduzione dell’assorbimento netto di fluido del 30%, un valore simile a quello che si ottiene negli epiteli non-FC stimolando direttamente la secrezione di cloruro mediata da CFTR. Questo risultato indica che la riduzione della proteina ENaC produce effetti che compensano a livello funzionale il difetto causato dalla mancanza di una CFTR attiva.
Per confermare questa indicazione sperimentale, abbiamo misurato direttamente lo spessore del fluido periciliare. Per questi esperimenti abbiamo utilizzato un microscopio confocale. Questo tipo di microscopio permette di generare un’immagine tridimensionale del campione in esame, in questo caso del fluido periciliare. Abbiamo potuto verificare che, negli epiteli trattati con i siRNA anti-ENaC, lo strato di fluido è significativamente più spesso che negli epiteli non trattati. In particolare, il valore negli epiteli FC trattati è risultato paragonabile a quello di epiteli normali con CFTR attiva. Con questi risultati abbiamo appurato che la nostra strategia per ridurre l’assorbimento di acqua e sodio mediato dal canale ENaC migliora significativamente il livello d’idratazione dell’epitelio bronchiale derivato da pazienti FC.
Abbiamo voluto confrontare il risultato raggiunto riducendo l’attività dell’ENaC con quello che si può ottenere usando una strategia farmacologica per recuperare la funzione del canale CFTR mutato. Sono stati utilizzati, in maniera associata, il correttore VX-809 (Lumacaftor) e il potenziatore VX-770 (Ivacaftor o Kalydeco) prodotti dalla compagnia Vertex per correggere il difetto di maturazione proteica e di attività causato dalla mutazione F508del 2,3. I nostri esperimenti hanno dimostrato che la combinazione dei due farmaci riesce ad aumentare effettivamente lo spessore del fluido periciliare, un risultato simile a quello ottenuto attraverso l’inibizione del canale ENaC. In entrambi i casi, l’aumento d’idratazione della superficie epiteliale dovrebbe assicurare un miglioramento della funzione mucociliare e quindi del difetto di base FC.
In conclusione, la nostra strategia per ridurre l’attività del canale ENaC ha dimostrato che i siRNA anti-ENaC provocano una riduzione dell’assorbimento intracellulare di fluido, che migliora l’idratazione dell’epitelio bronchiale di pazienti FC in vitro. Questa scoperta è particolarmente rilevante perché ci sono molti tipi di mutazioni che portano a una perdita d’attività della proteina CFTR e che fino ad oggi non possono essere trattate direttamente con farmaci, quali il VX-809 e il VX-770; in questi casi la possibilità di inibire il canale EnaC rappresenta una modalità di intervento sul difetto genetico di base diversa dal trattamento farmacologico rivolto alla mutazione stessa ma egualmente efficace. Un ostacolo da superare per le molecole di siRNA è la veicolazione all’interno delle cellule epiteliali. Mentre è possibile far entrare le molecole di siRNA nelle cellule epiteliali quando queste sono in coltura, non è così semplice fare lo stesso nelle cellule dei pazienti in vivo. Quando verranno perfezionati dei sistemi capaci di distribuire efficacemente le molecole di siRNA nel polmone, la strategia basata sul silenziamento del canale ENaC sarà un’altra arma a disposizione contro la FC.
Riferimenti bibliografici:
1. Gianotti A, Melani R, Caci E, Sondo E, Ravazzolo R, Galietta LJ, Zegarra-Moran O. ENaC Silencing as a Strategy to Correct the Airway Surface Fluid Deficit in Cystic Fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 2013 (epub ahead of print).
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3. Ramsey BW, Davies J, McElvaney NG, Tullis E, Bell SC, Dřevínek P, Griese M, McKone EF, Wainwright CE, Konstan MW, Moss R, Ratjen F, Sermet-Gaudelus I, Rowe SM, Dong Q, Rodriguez S, Yen K, Ordoñez C, Elborn JS; VX08-770-102 Study Group. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 2011; 365:1663-72.
Questo studio è stato condotto sulla base del progetto FFC#7/2009 finanziato da Fondazione Ricerca Fibrosi Cistica
