High-Content siRNA Screen Reveals Global ENaC Regulators and Potential Cystic Fibrosis Therapy Targets.
Almaça J, Faria D, Sousa M, Uliyakina I, Conrad C, Sirianant L, Clarke LA, Martins JP, Santos M, Heriché JK, Huber W, Schreiber R, Pepperkok R, Kunzelmann K, Amaral MD.
Cell 2013; 154:1390-400
PREMESSE
Il numero di pazienti FC che apparentemente potrà trarre beneficio dell’Ivacaftor è limitato a quei pazienti che portano mutazioni, come la G551D, che permettono alla proteina di essere sintetizzata e processata correttamente, ma che quando arriva alla membrana cellulare presenta un difetto di funzionamento. Questi pazienti rappresentano meno del 5% del totale. Per altri tipi di mutazioni è necessario trovare farmaci con meccanismo d’azione diverso e mutazioni-specifico, e questo complica il panorama delle terapie dirette a correggere il difetto della proteina CFTR. Da qualche anno si è pensato di esplorare una via alternativa che sia mutazione-indipendente. Invece di cercare di ripristinare la funzione della CFTR mutata e quindi la secrezione all’esterno della cellula di acqua e cloro, l’idea é quella di ridurre l’attività del canale del sodio epiteliale ENaC (Epithelial Na+ Channel), responsabile dell’assorbimento di fluidi all’interno della cellula. Riducendo l’assorbimento dei fluidi, sarebbe possibile compensare il difetto di secrezione e quindi migliorare attraverso questa via il livello d’idratazione delle vie aeree. Quella di inibire l’attività del canale ENAC non è un’idea nuova. In passato si è cercato di ottenere questo risultato usando il ben noto diuretico amiloride o alcuni dei suoi derivati, tutti bloccanti del canale ENaC, ma l’effetto è stato sempre di breve durata, probabilmente perché il farmaco viene assorbito molto velocemente (1,2). Più recentemente noi abbiamo usato piccole molecole di RNA (siRNA) con capacità di spegnere specificamente il canale ENaC per diversi giorni, dimostrando che la riduzione dell’attività dell’ENaC effettivamente porta a un ridotto assorbimento di fluido e migliora l’idratazione dell’epitelio bronchiale in vitro (3).
MATERIALE E METODI
Nell’ultimo numero della rivista Cell è stato pubblicato un lavoro su quest’argomento (4). Lo scopo dello studio è l’identificazione di nuovi attivatori dell’ENaC che possano essere candidati per lo sviluppo di farmaci. L’idea del progetto è che l’inibizione farmacologica di questi nuovi attivatori del canale ENaC porterebbe, indirettamente, a una riduzione dell’attività di questo canale con il risultato di una migliore idratazione delle vie aeree dei pazienti FC. Per raggiungere l’obiettivo di identificare attivatori finora sconosciuti dell’ENaC gli autori hanno usato un saggio basato sullo spegnimento sistematico con siRNA di circa 6400 geni, seguito dalla valutazione dell’effetto che ogni spegnimento aveva sull’attività dell’ENaC (valutazione primaria).
RISULTATI
Il risultato di quest’analisi è stato l’identificazione di 160 geni che potrebbero essere attivatori del canale ENaC. Per essere sicuri del coinvolgimento di questi geni nella regolazione dell’ENaC come fenomeno generale è necessaria una conferma con metodi diversi dal saggio originale e possibilmente su modelli cellulari diversi (valutazione secondaria). Ed è quello che fanno gli autori su 2 dei geni identificati, il recettore del fattore neurotrofico ciliare (CNTFR) e una chinasi del diacilglicerolo (DGKi). Per la valutazione secondaria gli autori si concentrano sopratutto su quest’ultima proteina perché nella loro analisi bioinformatica sembra che DGKi sia funzionalmente molto vicino all’ENaC e perché, essendo una chinasi, può essere inibita con piccole molecole. La valutazione secondaria viene fatta misurando l’attività dell’ENaC in epiteli tracheali di topi e usando un inibitore (di laboratorio) non specifico di chinasi DGK. In queste condizioni gli autori confermano che l’attività dell’ENaC si riduce del 50%. Ancora più importante, l’inibitore delle DGK riduce sensibilmente l’attività dell’ENaC e l’assorbimento di fluido in epiteli primari di pazienti FC. Questi risultati suggeriscono i) che una delle chinasi DGK è effettivamente un regolatore dell’ENaC, e ii) che l’inibizione di questa chinasi potrebbe migliorare l’idratazione delle vie aeree dei pazienti CF. Dobbiamo ricordare però che si tratta di risultati ottenuti in vitro e che l’inibitore usato non è specifico, ma agisce su diverse chinasi e quindi probabilmente altera molte vie cellulari. Inoltre, dato che un inibitore della DGKi avrebbe un’azione indiretta e quindi probabilmente non completa dell’ENaC, bisogna verificare che in vivo il ridotto assorbimento di fluido sia sufficiente per migliorare significativamente l’idratazione delle vie aeree. Successivamente sarà necessario cercare inibitori di questa chinasi che possano essere usati come farmaci e valutare tutti gli aspetti necessari per proporle come farmaci candidati (efficacia, modo di applicazione – per via inalatoria o via sistemica – persistenza del’effetto, tossicità). In conclusione, è ancora troppo presto perché DGKi possa essere considerato una molecola candidata valida, ma l’articolo ha aperto una strada che senz’altro si può esplorare. Inoltre, sarà importante fare la valutazione secondaria degli altri geni identificati come attivatori dell’ENaC.
Riferimenti bibliografici:
1. Hofmann T, Senier I, Bittner P, Huls G, Schwandt HJ, Lindemann H. Aerosolized amiloride: dose effect on nasal bioelectric properties, pharmacokinetics, and effect on sputum expectoration in patients with cystic fibrosis. J Aerosol Med 1990;10:147-158.
2. Hirsh AJ, Sabater JR, Zamurs A, Smith RT, Paradiso AM, Hopkins S, Abraham WM, Boucher RC. Evaluation of second generation amiloride analogs as therapy for cystic fibrosis lung disease. J Pharmacol Exp Ther 2004;311:929-938.
3. Gianotti A, Melani R, Caci E, Sondo E, Ravazzolo R, Galietta LJ, Zegarra-Moran O. Epithelial sodium channel silencing as a strategy to correct the airway surface fluid deficit in cystic fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol 2013; 49(3):445-52
4. Almaça J, Faria D, Sousa M, Uliyakina I, Conrad C, Sirianant L, Clarke LA, Martins JP, Santos M, Heriché JK, Huber W, Schreiber R, Pepperkok R, Kunzelmann K, Amaral MD. High-Content siRNA Screen Reveals Global ENaC Regulators and Potential Cystic Fibrosis Therapy Targets. Cell. 2013;154:1390-400.
