Secondo gli esperti la terapia genica avrà un impatto significativo sulla salute dell’uomo nei prossimo futuro (1). È interessante ricordare che l’Agenzia Europea per i Farmaci (EMA) ha approvato una strategia di terapia genica, con modalità classica, per le forme più gravi di beta-talassemia: si chiama Zynteglo, viene somministrata al malato una sola volta, con una procedura simile al trapianto di midollo, allo scopo di correggere definitivamente il difetto genetico che causa la beta-talassemia (2). Vengono raccolte le cellule staminali del sangue del malato, contenenti il gene mutato e vengono corrette trattandole con un virus vettore (del gruppo dei Lentivirus) che trasporta al loro interno il gene normale per la sintesi dell’emoglobina. Dopo la correzione genetica vengono reinfuse nel midollo osseo del malato che da quel punto in poi produce emoglobina normale. Infatti la cellula staminale ha due caratteristiche che la rendono specialissima fra le altre cellule: è capace di replicarsi indefinitamente e, in opportune condizioni, di differenziarsi e dare origine a tutti i tipi di cellule mature che compongono il tessuto da cui è derivata (è la “madre di tutte le cellule”) e che si intende riprodurre nel soggetto da trattare.
Proprio per queste particolarità un gruppo di ricercatori dell’Università di Stantford (California) ha rivolto la sua attenzione alle cellule staminali identificabili nel tessuto sinonasale di pazienti FC sottoposti a chirurgia endoscopica (3). Queste cellule sono state chiamate “staminali delle cellule epiteliali delle vie aeree superiori” (UABCs: Upper Airway Basal Stem Cells). Sull’esempio di quanto fatto per le staminali delle cellule del sangue, i ricercatori hanno studiato la possibilità di correggere al loro interno il gene CFTR mutato per effetto della mutazione F508del. Hanno utilizzato per l’intento terapeutico, non l’inserimento dell’intero gene CFTR normale, come è previsto nella terapia genica classica (vedi sopra), ma la tecnica del gene editing, di cui abbiamo spesso parlato su questo sito (“la forbice molecolare”) (4). I soggetti FC in studio erano 6 omozigoti e 4 eterozigoti per la mutazione F508del. Per confrontare il comportamento delle loro UABCs con cellule più conosciute, il gene editing è stato applicato anche a cellule HBECs (Cellule dell’Epitelio Bronchiale), già prelevate in altra occasione in altri 6 omozigoti F508del.
Per mezzo di un virus vettore (AAV69 della famiglia degli Adenovirus) nelle UABCs sono stati inseriti due elementi: un molecola di RNA guida, che ha identificato all’interno del gene CFTR il tratto di DNA corrispondente alla mutazione F508del; e la forbice molecolare, l’enzima Cas9, che l’ha tagliato via. Al posto del frammento eliminato è stato inserito quello con sequenza normale. È stato controllato che questa manipolazione del DNA non avesse prodotto effetti indesiderati in altri geni (effetti off-target) e non ne sono stati trovati di rilevanti. Lo stesso è stato fatto nelle cellule bronchiali HBECs.
I ricercatori hanno poi verificato in quante cellule contenenti il gene CFTR mutato fosse avvenuta la correzione della mutazione: in circa il 30% delle cellule UABCs (sia omozigoti che eterozigoti F508del) e in percentuale ancora maggiore nelle cellule mature HBECs. Era necessario verificare se la correzione della mutazione F508del corrispondesse realmente alla produzione di proteina CFTR: è stato visto che la proteina era espressa (dosaggio Western Blot) in discreta quantità sia nelle UABCs che nelle HBECs. Oltre che misurare la quantità della proteina, era necessario provare che fosse funzionante: era possibile farlo misurando la corrente generata dal trasporto dello ione cloruro da parte di CFTR. Quanto più cloro passa, tanto maggiore è la corrente misurabile; studi precedenti hanno suggerito come potrebbe essere sufficiente recuperare un 15% del trasporto normale per prevenire gravi sintomi di malattia. Nelle UABCs geneticamente corrette il recupero era pari a circa il 30% del normale e nelle HBECs era ancora maggiore, intorno al 60%, ma erano pazienti diversi, per cui il confronto ha dei limiti.
Comunque, soddisfatti del risultato, i ricercatori hanno indagato se le UABCs geneticamente corrette mantenessero le loro straordinarie caratteristiche: perciò le hanno inserite in una membrana speciale usata per questi scopi (ALI, Air Liquid Interface) e hanno osservato che si sono moltiplicate e trasformate in cellule di epitelio respiratorio di vario tipo: cellule basali, cellule ciliate e mucipare, disposte insieme a formare un epitelio respiratorio maturo.
L’ultimo esperimento eseguito aveva lo scopo di provare che le UABCs corrette potevano essere trapiantate su una membrana di sostegno (SIS, Small Intestine Submucosal, di derivazione porcina), che è abitualmente usata per molti scopi, compresa la riparazione post chirurgica dei seni paranasali. Questa membrana serve solo di sostegno all’epitelio e, quando le staminali cominciano a replicarsi, va incontro a degradazione naturale: le UASCs si sono impiantate nella SIS, si sono moltiplicate e hanno dato origine a epitelio respiratorio maturo, vitale e funzionante, anche dopo la scomparsa della membrana. I ricercatori hanno calcolato addirittura quante cellule staminali sarebbero necessarie per coprire l’intera superficie di un seno mascellare dopo il loro impianto (1,3 milioni di staminali geneticamente corrette).
Da questa prova di principio ex vivo, basata su epitelio di un seno paranasale (mascellare), è emersa l’ipotesi di procedere con studi in vivo nel malato. E sullo sfondo l’interrogativo: sarà possibile un intervento simile nel polmone FC?
Alcuni risultati del lavoro sono molto promettenti e richiederebbero di essere riprodotti presso altri laboratori. Altri aspetti sollevano alcuni quesiti: la (relativa) facilità di prelievo delle staminali nasali le renderebbe preferibili a quelle polmonari, ma rimane da stabilire in che misura l’epitelio nasale derivato da queste possa rappresentare l’epitelio bronchiale. Sono cellule di due distretti (le vie aeree superiori e inferiori) collegati ma distinti, per cui forse l’ideale sarebbe disporre di staminali da epitelio bronchiale, più difficili da reperire. E in ogni caso, le staminali (nasali o bronchiali), una volta corrette, con quale modalità potrebbero essere somministrate, al fine di coinvolgere estesamente l’albero respiratorio?
Chiederemo agli esperti di questa tematica un commento specifico, intanto possiamo dire che questo lavoro rappresenta un importante passo avanti nel percorso verso la terapia di gene editing: la strada è ancora lunga ma la velocità con cui si procede si sta rivelando maggiore del previsto.
1) AdvExpMedBiol. 2019 Dec 17. doi: 10.1007/5584_2019_463. [Epub ahead of print] The Horizon of Gene Therapy in Modern Medicine: Advances and Challenges. Arjmand B, Larijani B, Sheikh Hosseini M et al
2) www.osservatoriomalattierare.it/talassemia/15088-talassemia-la-comunita-scientifica-si-prepara-ad-accogliere-la-terapia-genica, 31/07/2019
3) Vaidyanathan S, Salahudeen AA, Sellers ZM et al “High-Efficiency, Selection-free Gene Repair in AirwayStemCells from CysticFibrosisPatientsRescues CFTR Function in DifferentiatedEpithelia”. Cell Stem Cell. 2019 Dec 11. pii: S1934-5909(19)30457-6. doi: 10.1016/j.stem.2019.11.002. [Epubahead of print]
4) I primi passi di editing genomico con tecnica CRISPR/Cas9 in alcune malattie genetiche e nella fibrosi cistica, 22/12/2017
