Negli USA l’industria propone una versione ottimizzata della tecnica del sequenziamento del gene CFTR per identificare il massimo numero di portatori FC nella popolazione generale.
La tecnica del sequenziamento del gene CFTR consiste nella lettura, base per base, della sequenza del DNA che compone il gene. È un procedimento che ha tempi lunghi di esecuzione e alto costo e come tale non ha caratteristiche ideali per un test di screening. Ci sono state però modifiche sostanziali della tecnica originale chiamate NGS, Next Generation Sequencing, che possono presentare vantaggi dovuti a maggiore rapidità e automatismo di esecuzione, assieme alla capacità di diagnosticare qualsiasi variante della sequenza normale del gene. Questa caratteristica si può tradurre però in uno svantaggio, perché vengono identificate non solo le varianti che hanno effetto patologico (le vere mutazioni) ma anche quelle di significato benigno oppure incerto o proprio sconosciuto. Quindi nel campo dello screening del portatore verrebbero identificati la maggior parte dei portatori (la sensibilità può arrivare al 95%), ma in un certo numero di soggetti sorgerebbero dubbi difficili da risolvere. Si stanno però concentrando gli sforzi per modificare la tecnica conservandone i vantaggi ed eliminando gli svantaggi, cosa già fatta anche da ricercatori italiani e di cui abbiamo dato notizia in una precedente recensione (1).
Sembra strano ma negli USA non c’è posizione diversa da vent’anni a questa parte circa il test per il portatore FC: 23 mutazioni del gene CFTR sono il pannello da usare per lo screening della popolazione generale americana, nonostante la varietà di etnie che la compone e i progressi delle conoscenze e delle tecniche molecolari. Anche nel 2017 una commissione di esperti interpellata ad hoc ha confermato questa posizione (2). Ma può essere oggi legittimo il dubbio che, con 23 mutazioni, ci sia un discreto numero di portatori che non viene identificato e che potrebbero essere presi in considerazione dagli esperti pannelli diagnostici più ampi o adattamenti delle nuove tecniche NGS.
Myriad Genetics è un’azienda californiana leader nel campo della diagnostica molecolare, impegnata nella ricerca e nella commercializzazione di test genetici (è di Myriad la commercializzazione di test genetici per il rischio di cancro alla prostata e di cancro ovarico). In un recente articolo (3) i ricercatori di Myriad si impegnano a dimostrare il vantaggio di un nuovo test basato su tecnica NGS per lo screening del portatore di mutazioni del gene CFTR. Commentiamo il lavoro pur con la premessa che quello che gli autori scrivono è chiaramente di parte e che alcuni passaggi metodologici non sono ben dettagliati. Lo facciamo però perché il messaggio che se ne ricava può essere utile anche per la realtà italiana dove un test di riferimento, valido in tutti i laboratori d’Italia, non è stato ancora individuato e dove le tecniche di sequenziamento del gene CFTR impropriamente usate creano molti problemi, in particolare la segnalazione di varianti geniche dal significato sconosciuto.
Alla base del lavoro di Myriad c’è l’ipotesi che i processi di interpretazione delle varianti di sequenza, una volta molto eterogenei, oggi siano più standardizzati e quindi la validità clinica delle varianti che un test NGS identifica possa essere accuratamente confermata per mezzo del confronto con quanto riportato da grandi e qualificati database genetici oggi esistenti, come il database CFTR2 (4).
Il test NGS costruito dalla Myriad per la diagnosi di portatore FC è già stato messo in commercio nel periodo giugno 2017 – maggio 2018 ed è stato usato in oltre 115.000 persone. Il test è basato sull’indagine di tutti gli esoni del gene CFTR e di limitate porzioni degli introni (qui non ci sono molti dettagli). In queste componenti del gene il test ha cercato le singole varianti nucleotidiche (SNVs, cioè corte delezioni e inserzioni di singole basi); e poi le varianti di numero di copie (CNV= Copy Number Variant) che sono delezioni, inversioni e duplicazioni di esoni. Non sono state incluse nella ricerca le varianti del sistema Poly-T perché considerato patogeno solo in presenza di altre varianti selezionate, né sono state incluse le varianti di significato sconosciuto o benigno. Le linee guida americane nel 2015 hanno dato suggerimenti precisi in questo senso (5, 6).
La validazione analitica del nuovo metodo (vale a dire la conferma dell’efficacia della tecnica) è stata realizzata su 33 pazienti anonimi usati come riferimento e su 88 linee cellulari, ed è consistita nel confermare il risultato eseguendo il test con il vecchio metodo del sequenziamento (metodo Sanger per SNVs) e l’indagine MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) per CNVs. Di particolare interesse è la procedura per la validazione clinica, che è stata realizzata paragonando le varianti identificate dalla tecnica NGS e il significato loro attribuito con le varianti incluse nel database CFTR2. Gli autori dicono che CFTR2 è la fonte più certa dal momento che le mutazioni che contiene sono derivate dallo studio di 89.000 pazienti con diagnosi certa di malattia FC, inoltre spesso c’è anche la caratterizzazione del meccanismo mutazionale con dati sperimentali in vitro. Tutte le varianti che il nuovo test NGS ha individuato nella popolazione testata (sono 213) sono state paragonate al CFTR2 (edizione agosto 2018) e sono risultate avere uguale interpretazione di patogenicità (tranne una). In più il nuovo test ne contiene altre 45 molto rare e non classificate nel CFTR2 (su queste nell’articolo non c’è molta chiarezza). Inoltre sono state diagnosticate varianti definite “a penetranza variabile” (possono comportarsi talvolta come variante benigna talvolta come vera mutazione) e anche qui c’è stata stretta concordanza con l’interpretazione data dal CFTR2 (solo tre casi discordanti).
Manca il dato finale della sensibilità e specificità ottenuta dal nuovo test nella popolazione scrinata (ben 115.000 persone). Sembra che lo sforzo sia stato orientato nella direzione di dimostrare che la nuova tecnica si ispira fedelmente a quanto riportato nel CFTR2, forse per promuovere il parere favorevole alle società scientifiche. C’è qualche dato sul comportamento delle coppie di portatori: le coppie scrinate con il nuovo test sono state 13.080 e 58 di queste sono risultate coppie ad alto rischio di avere figlio affetto da FC; su 58 solo 40 sarebbero state diagnosticate attraverso il pannello tradizionale basato su 23 mutazioni CFTR, mentre ben 18 (31%) sarebbero sfuggite. In queste 18 il partner apparteneva per lo più a etnia diversa da quella bianca (asiatica, ispanica).
Commento.
L’articolo non è scritto da autori indipendenti, ma comunque dice, a nostro avviso, alcune cose importanti. Queste nuove tecniche NGS oggi possono essere modificate a buon fine, così da offrire il massimo dei vantaggi e il minimo degli svantaggi, il che, in tema di screening del portatore, vuol dire diagnosticare il massimo numero dei portatori senza perdere nessuno di quelli con mutazioni rare (massima sensibilità) e nello stesso tempo non sollevare falsi problemi attribuendo la diagnosi a chi portatore non è (massima specificità). Il metodo NGS può essere corretto imponendogli alcuni vincoli tecnici, in modo che legga un altissimo numero di varianti con significato patologico certo e nel test del lavoro Myriad la certezza della patogenicità è stata desunta dal riferimento alle mutazioni dal CFTR2. Inoltre il metodo può essere condizionato in modo da tralasciare la lettura delle varianti con significato incerto. Infine, i dati clinici riportati indicano che nella vasta popolazione USA indagata il pannello di 23 mutazioni CFTR non diagnostica un discreto numero di coppie ad alto rischio di figli con fibrosi cistica, in particolare coppie in cui un partner apparteneva a etnia diversa da quella bianca (ispanica, asiatica). Sarà interessante vedere come risponderanno alle sollecitazioni dell’industria gli esperti delle società scientifiche americane, che finora hanno sostenuto la validità del pannello mutazionale ristretto per lo screening del portatore FC.
1) Un nuovo test genetico per fibrosi cistica (188-CF-NGS) costruito su misura per la popolazione italiana, 13/11/2017
2) Committee opinion n° 961 summary: carrier screening for genetic conditions .Obstet Gynecol 2017;129 :597-99
3) Beauchamp KA, Taber KAJ, Grauman PV, Spurka L, Lim-Harashima J, Svenson A, Goldberg JD, MuzzeyD. “Sequencing as a first-line methodology for cystic fibrosis carrier screening”. GenetMed. 2019 Oct;21(10):2407-2408.
4) cftr2.org
5) Richards S, Aziz N, Bale S “Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology”. Genet Med. 2015 May;17(5):405-24
6) Edwards JG, Feldman G, Goldberg J. “Expanded carrier screening in reproductive medicine-points to consider: a joint statement of the American College of Medical Genetics and Genomics, American College of Obstetricians and Gynecologists, National Society of Genetic Counselors, Perinatal Quality Foundation, and Society for Maternal-Fetal Medicine.”Obstet Gynecol. 2015 Mar;125(3):653-62.
