Recensione di pubblicazione da progetto FFC
Pseudomonas aeruginosa (Pa) è un patogeno diffuso e di difficile eradicazione in fibrosi cistica (FC), perchè tende a formare comunità batteriche rivestite da una pellicola indicata con il nome di biofilm, rendendosi così inattaccabile dalle difese immunitarie dell’ospite e dagli antibiotici. Le comunità Pa rivestite dal biofilm, una volta stabilite nel polmone, sono difficili da eradicare a causa della resistenza ai comuni antibiotici – che attaccano il batterio ma non sono specifici contro la formazione del biofilm – e alla capacità di resistere al sistema immunitario dell’ospite. In questo contesto si inserisce il filone di ricerca sui cosiddetti peptidi antimicrobici, su cui, dal 2011, Fondazione Ricerca Fibrosi Cistica (FFC) ha finanziato diversi progetti. Tra questi segnaliamo quattro progetti che si rivolgono in particolare al peptide antimicrobico esculentina (indicato con Esc(1-21)), derivato dalla pelle di rana.
Nel corso degli anni, i ricercatori coinvolti nei progetti coordinati da Maria Luisa Mangoni (Dip. Scienze Biochimiche, Università La Sapienza, Roma), hanno mostrato attraverso esperimenti in vitro e in vivo l’elevata efficacia dell’esculentina contro il biofilm di Pseudomonas aeruginosa. Il meccanismo d’azione dell’esculentina si basa sulla destabilizzazione della membrana microbica, essendo essa stessa un derivato della membrana esterna delle rane e quindi naturalmente incline a inserirsi in un ambiente simil-membrana tipo quello della membrana batterica e del biofilm batterico. Tuttavia, una preoccupazione comune nell’uso di tutti i peptidi antimicrobici come agenti terapeutici, risiede nella loro elevata suscettibilità alla degradazione a opera di specifici enzimi nell’organismo ospite. Infatti, i peptidi sono costituiti da corte catene di aminoacidi, costituenti base delle proteine: sono una specie di proteine molto corte (intorno a una ventina di aminoacidi). Queste catene peptidiche vengono riconosciute dall’organismo come composti estranei e biodegradabili e avviati appunto alla degradazione (con meccanismo di digestione ad opera di enzimi proteasici). Una strategia messa a punto dai ricercatori FFC è stata quindi quella di sostituire nella sequenza di aminoacidi del peptide originale Esc(1-21) due aminoacidi di sintesi, quindi non naturali, con struttura speculare a quella originale benchè compatibili con la struttura complessiva del peptide, sintetizzando così un composto analogo a Esc(1-21), che hanno chiamato con Esc(1-21)-1c. Questo nuovo peptide non viene riconosciuto dalle proteasi di degradazione e può avviarsi a svolgere la sua azione di destabilizzazione della membrana batterica.
Gli studi successivi hanno permesso di osservare una aumentata capacità ad opera di Esc(1-21)-1c di rimuovere il biofilm di Pseudomonas aeruginosa sia in vitro che in vivo, rispetto allo stesso Esc(1-21). Infatti, recentemente sono stati pubblicati due lavori (1, 2), frutto dei progetti FFC#14/2011 e 11/2014. Nel primo dei due lavori (1), in ordine temporale, i ricercatori riportano i risultati dei loro studi riguardo alla capacità dei due peptidi di prevenire la formazione del biofilm e una ipotesi sul meccanismo molecolare alla base di questa azione preventiva. I risultati ottenuti mostrano un andamento concentrazione-dipendente nella prevenzione della formazione del biofilm di Pseudomonas aeruginosa da parte sia di Esc(1-21) sia di Esc(1-21)-1c, indicando la necessità di lavorare a basse concentrazioni. Rispetto al peptide Esc(1-21), il suo analogo Esc(1-21)-1c si mostra più efficace nel prevenire la formazione della biomassa legata al biofilm, su tutti i ceppi del patogeno Pa analizzati. Il meccanismo molecolare proposto per questa attività di prevenzione è che il peptide interagisca con i geni di virulenza batterica, riducendo la motilità batterica; una ridotta motilità previene l’aggregazione batterica e la formazione del biofilm. I ricercatori hanno anche effettuato un confronto con gli antibiotici tradizionali (aztreonam e colistina) che, specialmente a concentrazioni elevate, stimolano la formazione di biofilm. I ricercatori non lo riportano esplicitamente, ma i risultati potrebbero far pensare che l’azione di Esc(1-21)-1c possa essere di disarmare il patogeno, inibendo la formazione del biofilm e consentendo agli antibiotici di agire a dosi inferiori.
Il secondo contributo (2) riporta come i ricercatori abbiano sviluppato con successo nanoparticelle contenenti sia Esc(1-21) sia Esc(1-21)-1c. Esse sono risultate in grado di veicolare attraverso il muco bronchiale, in maniera più efficace, il peptide antimicrobico precedentemente sintetizzato. L’utilizzo delle nanoparticelle è utile perché aumenta la biodisponibilità del peptide, proteggendolo dalla degradazione enzimatica, riduce la citotossicità dei peptidi in quanto non possono interagire con l’ambiente esterno alla nanoparticella e ottimizza la traslocazione del peptide allo specifico sito d’azione.
Complessivamente queste ricerche stanno fornendo risultati promettenti e per il 2019 è stato proposto per il finanziamento un nuovo progetto coordinato dalla stessa Maria Luisa Mangoni (FFC #8/2019). Sulla base dei risultati già ottenuti, verranno prodotte ulteriori quantità di nanoparticelle polimeriche, per la veicolazione e il rilascio controllato a livello polmonare dei peptidi antimicrobici selezionati, e proseguiranno gli studi preclinici per determinare il profilo di sicurezza a livello polmonare e la risposta dell’ospite alla loro somministrazione.
Progetti FFC#14/2011, FFC#11/2014 e FFC#15/2017 coordinati da Maria Luisa Mangoni (Dipartimento di Scienze Biochimiche dell’Università La Sapienza di Roma) e finanziati con il supporto di Gruppo di sostegno FFC di Seregno; Delegazione FFC di Foggia; Carla Silvia Ubertalli a ricordo di Marcella Ubertalli Ferrero Ventimiglia; Delegazione FFC di Palermo; Delegazione FFC di Vittoria, Ragusa e Siracusa; Delegazione FFC di Catania Mascalucia; Delegazione FFC di Messina; Gruppo di Sostegno FFC di Tremestieri; Delegazione FFC di Siena; Delegazione FFC di Sondrio Valchiavenna; Delegazione FFC “Il sorriso di Jenny”; Delegazione FFC di Pavia.
The Italian Cystic Fibrosis Research Foundation (FFC) has been founding since 2011 research projects aimed at developing Antimicrobial Peptides (AMPs). Thanks to those research grants, led by Maria Luisa Mangoni (Università La Sapienza, Roma), two derivatives of the frog skin antimicrobial peptide esculentin-1a, i.e. Esc(1-21) and its D-amino acids containing diastereomer Esc(1-21)-1c, were characterized for their powerful anti-Pseudomonal activity. In a recent paper (1), researchers studied how the diastereomer Esc(1-21)-1c can inhibit Pseudomonas biofilm formation when applied at dosages below the minimal growth inhibitory concentration. Biofilm prevention was correlated to the peptides’ ability to inhibit Pseudomonas motility and to reduce the production of virulent metabolites. Another paper (2), reports how nanoparticles for lung delivery of AMPs were successfully developed. Improved peptide transport through artificial CF mucus and simulated bacterial extracellular matrix was achieved in vitro. The formulations were effectively delivered through a liquid jet nebulizer already available to patients. Notably, Esc peptide-loaded nanoparticles displayed an improved efficacy in inhibiting P. aeruginosa growth in vitro and in vivo in the long term. These pieces of research confirm the potential of Esc(1-21) e Esc(1-21)-1c as anti-Pseudomonal agents and encourage the new studies that are currently under investigation (FFC#8/2019).
1) Casciaro B, Lin Q, Afonin S, Loffredo MR, de Turris V, Middel V, Ulrich AS, Di YP, Mangoni ML. Inhibition of Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and expression of virulence genes by selective epimerization in the peptide Esculentin-1a(1-21)NH2. FEBS J. 2019 Oct;286(19):3874-3891. doi: 10.1111/febs.14940. Epub 2019 Jun 13.
2) Casciaro B, d’Angelo I, Zhang X, Loffredo MR, Conte G, Cappiello F, Quaglia F, Di YP, Ungaro F, Mangoni ML. Poly(lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Prolonged Therapeutic Efficacy of Esculentin-1a-Derived Antimicrobial Peptides against Pseudomonas aeruginosa Lung Infection: in Vitro and in Vivo Studies. Biomacromolecules. 2019 May 13;20(5):1876-1888. doi: 10.1021/acs.biomac.8b01829. Epub 2019 Apr 23.
