I pazienti con fibrosi cistica presentano in genere sintomi specifici, aumento del cloro nel sudore e due mutazioni del gene CFTR. Oltre alla forma classica di malattia, oggi si conoscono con sempre maggiore frequenza forme atipiche, che si manifestano con sintomi molto variabili, test del sudore normale o borderline e spesso una sola mutazione, se si analizzano pannelli ristretti di mutazioni. In questi casi le indagini genetiche di approfondimento (sequenziamento del gene) e i test funzionali (analisi dei potenziali nasali o misura della corrente intestinale) sono complicati e invasivi, disponibili in pochi centri. Per questo motivo, abbiamo deciso di sviluppare un sistema alternativo, basato su un prelievo (brushing, lieve spazzolamento) di cellule nasali del paziente, successiva loro coltura e analisi con tecnologie molecolari avanzate. Queste permetteranno di: 1) identificare l’effetto di mutazioni nuove (ridotta produzione o localizzazione anomala di CFTR nella cellula o cattivo funzionamento del canale CFTR e quindi 2) aiutarci a fare una diagnosi differenziale precisa di fibrosi cistica classica o atipica o di malattia FC correlata; infine, eventualmente 3) riconoscere i portatori sani, e monitorare i pazienti CF durante le nuove terapie con potenziatori o correttori.
In the diagnostic process of CF, CFTR-RD and cases with atypical clinical presentation there are some weak points. Thus the main objectives of this study are to develop and test on a large number of patients with CF, atypical forms of the disease and controls, the analysis of epithelial cells obtained by nasal brushing. We’ll set up a cell culture, and a series of analyzes based on advanced molecular technologies. In particular, we plan to develop methods that can help: i) to identify the effect of new mutations (reduced protein production, mislocalization of the protein, altered protein activity), ii) to make a precise differential diagnosis of CF, CFTR-RD, possibly to recognize healthy carriers, and monitor patients during new CF therapies with correctors and potentiators. The analysis of the effect of mutations of uncertain significance on nasal cells will be performed as follows: RT-PCR for quantitative analysis of CFTR mRNA; electrophoresis to assess the splicing; monoclonal antibodies and confocal microscopy for protein topogenesis; western-blot for semi-quantitative analysis of CFTR protein; halide-sensitive fluorescent system for CFTR gating activity. This latter procedure will be used to create a quantitative marker useful to discriminate between CF and CFTR-RD, to specifically identify CF carrier subjects and to monitor CF patients during novel therapies with CFTR correctors and potentiators. This approaches, once validated on a large number of cases will be easily converted in prototipal kits for a routine use.
