L’editing genomico per la riparazione di mutazioni di splicing: dalla scoperta di CRISPR-Cas alle prospettive terapeutiche

L’editing genomico (in inglese genome editing) è una tecnologia che permette di modificare il DNA all’interno di una cellula, quindi all’interno di un essere vivente. Tecniche per ingegnerizzare (modificare) il DNA in vitro, quindi al di fuori della cellula, sono state sviluppate pochi decenni dopo la scoperta del DNA, avvenuta a metà del ‘900. Queste tecniche sono alla base di importanti avanzamenti nel campo della biomedicina, basti pensare ai progressi ottenuti con i metodi del DNA ricombinante, tra cui la produzione dell’insulina.
Tuttavia queste tecniche non permettono di modificare il DNA in vivo, cioè all’interno della cellula, procedura necessaria per correggere le mutazioni alla base delle malattie genetiche come la fibrosi cistica. Raggiungere la cellula e modificare il DNA in vivo ha presentato a lungo enormi ostacoli ai ricercatori: la svolta è avvenuta recentemente, nel 2012, con la scoperta nei batteri del sistema CRISPR-Cas.

Come funziona CRISPR-Cas
CRISPR-Cas è un complesso di molecole che viene usato dai batteri per difendersi dagli attacchi dei virus. È composto da una parte proteica, Cas, che funziona da nucleasi cioè genera tagli nel DNA dei virus invasori, e da una porzione a RNA che viene usata per riconoscere il DNA virale. Quindi in un certo senso l’RNA fa da guida (infatti tecnicamente viene chiamato RNA guida) e porta in maniera precisa la nucleasi (la forbice) sul DNA virale da tagliare. Il tutto deve avvenire con grande precisione per evitare che il complesso CRISPR-Cas tagli per errore il DNA del batterio stesso piuttosto che quello del virus invasore.
Questo meccanismo messo a punto dai batteri per tagliare in maniera “sartoriale” specifiche sequenze di DNA virale è esattamente il meccanismo di modifica del DNA cellulare che i ricercatori cercavano di mettere a punto con scarso successo.

Il lavoro che ha portato al premio Nobel per la Chimica nel 2020 le ricercatrici Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna consiste nel trasferimento del sistema molecolare batterico CRISPR-Cas all’interno di cellule di mammifero per la manipolazione genetica. Nelle cellule di mammifero vengono introdotte la porzione proteica (Cas) e la guida RNA affinché, assieme, possano individuare la sequenza mutata e tagliarla per indurre riparazioni genetiche. La scoperta di CRISPR-Cas come tecnologia per l’editing genomico ha aperto nuovi orizzonti per la cura di malattie genetiche.

L’editing genomico per le mutazioni di splicing in fibrosi cistica
Nel campo della fibrosi cistica, la tecnologia CRISPR-Cas è stata molto usata per riparare mutazioni di splicing nel gene CFTR. Ogni gene all’interno del genoma umano è costituito da una parte di sequenza che contiene l’informazione per produrre la proteina, gli esoni, e una parte con funzione regolatrice, gli introni. Per ottenere il prodotto finale, cioè la proteina (vedi CFTR), i geni vengono copiati in molecole intermedie chiamate RNA messaggeri. Questi RNA prima di potere essere tradotti in proteina attraversano una fase di maturazione durante la quale le sequenze introniche vengono eliminate per lasciare solo gli esoni. Questo processo di maturazione prende il nome di splicing: senza uno splicing corretto, la proteina non può essere prodotta.

La tecnologia dell’editing genomico tramite CRISPR-Cas è particolarmente compatibile con questo tipo di mutazioni. La ragione principale è che le mutazioni di splicing si trovano all’interno degli introni, per cui le operazioni di manipolazione genetica sono più sicure e limitano gli eventuali danni alla parte del gene più vulnerabile, cioè quella che contiene l’informazione di codifica della proteina CFTR. Infatti, l’editing genomico, soprattutto la prima versione della tecnologia, può lasciare cicatrici nel sito di riparo.
A oggi sono riportate strategie valide per la riparazione delle mutazioni 3272–26A>G, 3849+10kbC>T 1811+1.6kbA>G. Con il supporto della Fondazione Ricerca Fibrosi Cistica il Laboratorio di Virologia Molecolare dell’Università di Trento si sta occupando della correzione delle mutazioni 2789+5G>A e 1717-1G>A (progetti FFC#1/2017, FFC#3/2019, FFC#2/2021).

Modelli sperimentali per la ricerca in fibrosi cistica
La messa a punto dell’editing genomico prevede diversi passaggi di laboratorio per perfezionare la strategia e renderla più efficace e precisa: ciò implica un’intensa attività sperimentale per valutare le diverse combinazioni di sistemi CRISPR-Cas. A tal fine, servono modelli cellulari facilmente coltivabili in laboratorio e in grado di mimare e rendere facilmente individuabile l’alterazione genica che porta all’errore di splicing. A questo proposito sono molto utili i minigeni, cioè porzioni di gene generate con tecniche di ingegneria genetica e successivamente introdotte in linee cellulari dove l’alterazione dello splicing si può osservare con tecniche standard di analisi dell’RNA.

I modelli di cellule con all’interno minigeni crescono facilmente in laboratorio e sono facilmente manipolabili in quanto permissivi all’introduzione del DNA per l’espressione del sistema CRISPR-Cas, necessario per riparare la mutazione. Una volta messa a punto la strategia, i passaggi successivi prevedono una validazione in modelli cellulari con maggiore rilevanza dal punto di vista clinico come le cellule epiteliali derivate da pazienti FC con mutazioni di splicing. Un modello sperimentale ancora più vicino all’applicazione clinica è rappresentato dagli organoidi, strutture tridimensionali fatte di cellule che, come dice il nome, si organizzano per replicare l’organo da cui provengono. In fibrosi cistica sono stati messi a punto in particolare organoidi intestinali.
Nelle cellule e negli organoidi derivati da pazienti FC viene poi applicato il genome editing messo a punto nelle linee cellulari e viene effettuata un’analisi genetica per valutare la correzione e la precisione (eventuali tagli fuori bersaglio) di CRISPR-Cas sulle mutazioni di splicing. Inoltre, vengono effettuati saggi funzionali per misurare il ripristino della funzione di CFTR.
A oggi l’editing genomico messo a punto in laboratorio ha generato risultati molto incoraggianti dal punto di vista terapeutico.

Nel campo della terapia genica, in cui si colloca l’editing genomico per il trasferimento di CRISPR-Cas per il riparo genico, rimane ora un importante traguardo da raggiungere che consiste nella messa a punto di sistemi di trasporto di DNA e RNA all’interno delle cellule bersaglio. Su questo fronte c’è uno sforzo globale nel mondo della ricerca fortemente sostenuto proprio dai risultati incoraggianti dell’editing genomico che apre a soluzioni terapeutiche impensabili fino agli anni recenti.