Recensione di pubblicazione da progetto FFC
La mutazione più frequente nei pazienti FC, la F508del, provoca un difetto di maturazione (folding) e di migrazione alla membrana cellulare (trafficking) della proteina Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR) e la sua degradazione prima di raggiungere la membrana cellulare. Il difetto di stabilità può essere trattato con molecole chiamate correttori, anche se le evidenze sperimentali degli ultimi anni hanno mostrato che un singolo correttore non è sufficiente a promuovere un recupero farmacologicamente rilevante della CFTR-F508del. Devono quindi essere scoperti nuovi target terapeutici e nuovi modulatori che agiscano su questi target, in modo da poter metter sul mercato farmaci più efficaci.
I meccanismi con cui i correttori agiscono non è completamente noto e ne sono stati proposti diversi. Potrebbero agire stabilizzando una specifica area (dominio) della proteina CFTR mutata, oppure migliorando l’interazione tra i diversi domini o, infine, agendo non direttamente sulla CFTR ma piuttosto sulle proteine che impediscono la migrazione di CFTR e ne promuovono la degradazione. In particolare questi secondi sono detti modulatori della proteostasi, essendo la proteostasi il meccanismo che tiene in equilibrio la sintesi e la degradazione di una proteina. I progetti FFC 2/2015, coordinato da Andrea Cavalli (Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie – Università di Bologna), e FFC 5/2012, coordinato da Nicoletta Pedemonte (Lab. Genetica Molecolare, Ist. G. Gaslini, Genova), avevano permesso di identificare una particolare proteina denominata RNF5/RMA1 come coinvolta nella proteostasi di CFTR, al punto che se essa veniva geneticamente soppressa in vivo, su modelli murini omozigoti F508del, si osservava un aumento dell’attività di CFTR in cellule epiteliali intestinali con conseguente attenuazione dei sintomi collegati al malassorbimento intestinale. Ecco quindi che RNF5 può rappresentare un bersaglio terapeutico per FC.
Con il progetto FFC 9/2017, coordinato sempre da Nicoletta Pedemonte, i ricercatori vogliono quindi effettuare lo screening di milioni di molecole chimiche, per trovare quella più efficace contro RNF5 e in grado di portare in membrana la proteina mutata, esercitando un effetto correttore maggiore di quelli già noti. In una recente pubblicazione, i ricercatori (1) riportano i risultati ottenuti attraverso un approccio computazionale, ossia uno screening virtuale di piccole molecole in grado di inibire RNF5. Gli autori hanno dapprima costruito al computer la struttura tridimensionale di RNF5 e, attraverso una simulazione al calcolatore della durata di qualche centinaia di miliardesimo di secondo – per i movimenti conformazionali di una proteina sono tempistiche rilevanti – hanno raggruppato 10 possibili conformazioni tra cui oscillerebbe la RNF5 in condizioni fisiologiche. Queste conformazioni, sempre al calcolatore, sono state testate per la loro capacità di essere colpite da un’opportuna molecola con funzione di inibitore, che si andasse a legare alla loro struttura 3D.
Sono stati testati 10.000 possibili inibitori di RNF5 e, attraverso lo screening virtual, sono state scelte 2623 molecole già commercialmente disponibili, che sono state testate su modelli cellulari. La seconda parte del lavoro riporta cosa emerge dagli studi in vitro degli inibitori di RNF5 selezionati attraverso il calcolatore. Lavorando su cellule bronchiali umane da pazienti FC con mutazione F508del, non senza fatica e anche qualche risultato poco incoraggiante, il progetto ha portato infine all’identificazione di un composto, che gli autori hanno chiamato inh-2, in grado di inibire efficacemente RNF5 e quindi agire come correttore di CFTR con mutazione F508del. Gli autori non escludono che inh-5 possa colpire qualche altro bersaglio oltre a RNF5, ma appare confermato che l’inibizione di RNF5 può recuperare il difetto di folding e di trafficking della mutazione F508del in colture primarie di cellule epiteliali bronchiali, che sono il tessuto più importante per i malati FC. Questi risultati convalidano RNF5 come possibile bersaglio per composti trasformabili in farmaci con azione di correttori in fibrosi cistica.
Finanziamenti della Fondazione per la Ricerca sulla Fibrosi Cistica: FFC 2/2015, con il contributo di Delegazione FFC di Verona, Delegazione FFC di Tradate Gallarate, dell’evento ‘‘La Notte dei Sapori’’ e dell’Azienda Audemars Piguet Italia; FFC 5/2012, con il contributo di Danone S.p.A.; FFC 9/2017, con il contributo di Delegazione FFC di Genova e Gruppo di Sostegno FFC di Savona Spotorno’, dell’evento “Un fiore per Valeria” (Assemini – Cagliari), del Gruppo di Sostegno FFC di Vigevano, della Delegazione FFC della Valdadige e Delegazione FFC di Lodi.
In cystic fibrosis (CF), deletion of phenylalanine 508 (F508del) in the CFTR channel is associated with misfolding and premature degradation of the mutant protein. Among the known proteins associated with F508del-CFTR processing, the ubiquitin ligase RNF5/RMA1 is particularly interesting. Through FFC Grants # 2/2015 # 5/2012, coordinated by Andrea Cavalli and Nicoletta Pedemonte respectively, it was demonstrated that genetic suppression of RNF5 in vivo leads to an attenuation of intestinal pathological phenotypes in CF mice, validating the relevance of RNF5 as a drug target for CF. In a recent paper (1), supported by Grant FFC # 9/2017 the authors used a computational approach to discover inh-02, a drug-like small molecule that inhibits RNF5. In immortalized and primary bronchial epithelial cells derived from CF patients homozygous for the F508del mutation, long-term incubation with inh-02 caused significant F508del-CFTR rescue. This work validates RNF5 as a drug target for CF, providing evidence to support its druggability.
(1) Sondo E, Falchi F, Caci E, Ferrera L, Giacomini E, Pesce E1, Tomati V, Mandrup Bertozzi S, Goldoni L, Armirotti A, Ravazzolo R, Cavalli A, Pedemonte N. Pharmacological Inhibition of the Ubiquitin Ligase RNF5 Rescues F508del-CFTR in Cystic Fibrosis Airway Epithelia. Cell Chem Biol. 2018 Apr 26. pii: S2451-9456(18)30124-7. doi: 10.1016/j.chembiol.2018.04.010. [Epub ahead of print].
