La fibrosi cistica (FC) è una malattia complicata con una causa semplice: la mutazione di un solo gene che dà luogo a una proteina difettosa. Una proteina è una sequenza di aminoacidi legati tra di loro: quelli possibili sono venti e grazie alle loro distinte proprietà (polarità, idrofobicità, carica, volume, ecc.), la proteina si “arrotola” in un modo specifico che ne determina la funzione. Quindi, la struttura della proteina è strettamente legata al suo funzionamento, e una piccola variazione della struttura porta ad una disfunzione, dato che allora la proteina non riesce a avvolgersi correttamente, o non arriva alla regione della cellula dove deve funzionare, determinando in entrambi i casi una conseguenza patologica. Nella FC questa proteina, denominata CFTR, è una proteina che deve arrivare alla membrana cellulare per regolare il trasporto di cloro, quindi di sale e di acqua. La sua disfunzione o mancato arrivo al bersaglio produce una cascata di eventi che portano alla FC.
Un modo per capire quale è la ragione per cui una proteina difettosa, una CFTR “mutante”, funziona male o non funziona affatto, e magari capire anche come fare a correggerne il difetto, è conoscere con la massima precisione quale è la struttura molecolare della proteina. Questo vuol dire conoscere come si dispongono nello spazio gli atomi degli aminoacidi, per capire come la proteina si “arrotola”, come si “muovono” i pezzi che la compongono e la rendono funzionante, cosa viene modificato in presenza di una mutazione, e infine come interagisce la proteina con, per esempio, sostanze che sono candidate a diventare possibili farmaci.
Per lo studio della struttura delle proteine ci viene in aiuto una branca “ibrida” della biologia, la biofisica, che studia i sistemi viventi con i metodi della fisica. Grazie al supporto della FFC, noi abbiamo affrontato il problema dello studio della struttura della CFTR partendo da lontano. La prima osservazione è stata che alcune sostanze individuate nella ricerca di nuovi farmaci per la FC avevano, con alcune mutazioni, una potenza diversa in due regioni della CFTR, denominate NBD (Nucleotide Bindings Domains). Questi NBD sono responsabili dell’apertura e della chiusura della via di passaggio, il canale per il cloro. Quindi, mediante studi di simulazioni di strutture al calcolatore e il confronto con i dati sperimentali, abbiamo individuato la regione degli NBD dove probabilmente si legano questi possibili farmaci[1], e successivamente abbiamo confermato questa localizzazione mediante esperimenti mirati [2,3].<
A quel punto era d’obbligo cercare di dare una base “strutturale” a questa ipotesi, e quindi abbiamo iniziato lo studio strutturale della CFTR. Il guaio è che lo studio di una proteina così “grande” come la CFTR non è cosa da niente. Quindi abbiamo iniziato con lo studio dei soli frammenti di CFTR implicati nei nostri esperimenti, prodotti individualmente in batteri e purificati. Mediante una combinazione di metodi biochimici, spettroscopici, e sopratutto con una tecnica denominata “dispersione di raggi X” (X-ray scattering), che usa radiazione di sincrotrone per lo studio delle molecole in soluzione, abbiamo dimostrato che i NBD cambiano di conformazione quando legano l’ATP, che è la molecola intracellulare che, fornendo energia, determina l’apertura e la chiusura del canale CFTR [4]. Più recentemente abbiamo mostrato come un “potenziatore”, cioè una sostanza in grado di far funzionare la CFTR difettosa arrivata sulla membrana cellulare, modifica sostanzialmente la struttura molecolare degli NBD, così come la loro interazione con le molecole di ATP [5].
Queste scoperte ci hanno permesso di ipotizzare che il meccanismo d’azione dei “potenziatori” potrebbe essere associato al legame di queste molecole con i NBD, e consisterebbe nel modificare la loro struttura e quindi la loro capacità d’interazione con altre regioni della CFTR. Una di queste regioni è il Dominio Regolatorio (RD). Abbiamo, dunque, iniziato a studiare le proprietà del Dominio Regolatorio, che è la regione della proteina responsabile della risposta della CFTR agli stimoli esterni (ad esempio ormoni). Per ora, mediante tecniche spettroscopiche, abbiamo dimostrato che questa ingarbugliatissima regione – classificata come “proteina intrinsecamente disordinata” – cambia anch’essa di conformazione quando è attivata (fosforilata) [6]. Questa scoperta, che abbiamo confermato mediante esperimenti al sincrotrone, che pubblicheremo a breve, ci apre le porte per affrontare uno studio strutturale della interazione tra queste diverse regioni della CFTR.
In conclusione, mediante metodi derivati puramente dalla fisica abbiamo affrontato un problema biomedico e questo ci sta permettendo di capire come funziona la CFTR a livello molecolare, e come questo funzionamento possa essere modificato da farmaci. Queste conoscenze potranno eventualmente riflettersi in un disegno più ragionato e ottimizzato di nuovi farmaci per trattare la malattia FC determinata da alcune mutazioni del gene CFTR.
1- Moran O, Galietta LJV, Zegarra-Moran O. (2005) Binding site of activators of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in the nucleotide binding domains. Cell Mol Life Sci. 62:446-460.
2- Zegarra-Moran O, Monteverde M, Galietta LJV, Moran O. (2007) Functional analysis of mutations in the putative binding site for cystic fibrosis transmembrane conductance regulator potentiators. Interaction between activation and inhibition. J Biol Chem. 282:9098-9104.
3- Melani R, Tomatis V, Galietta LJV, Zegarra-Moran O. (2010) Modulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) activity and genistein binding by cytosolic pH. J Biol Chem. 285:41591-41596.
4- Galeno L, Galfrè E, Moran O. (2011) Small-angle X-ray scattering study of the ATP modulation of the structural features of the nucleotide binding domains of the CFTR in solution. Eur Biophys J. 40:811-824.
5- Galfrè E, Galeno L, Moran O. (2012) A potentiator induces conformational changes on the recombinant CFTR nucleotide binding domains in solution. Cell Mol Life Sci. DOI 10.1007/s00018-012-1049-7 .
6- Marasini C, Galeno L, Moran O. (2012) Thermodynamic study of the native and phosphorylated regulatory domain of the CFTR. Biochem Biophys Res Commun: http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2012.05.165 .
