Screening di iRNA per trovare le proteine che bloccano la maturazione di DF508
I meccanismi molecolari alla base del difetto di maturazione della proteina CFTR-DF508 mutata non sono ancora del tutto conosciuti. E’ invece fondamentale conoscere quali siano le proteine e i percorsi che sono d’ostacolo alla migrazione della proteina sulla membrana delle cellula epiteliale. Sono state identificate numerose piccole molecole che possono correggere (o potenziare) CFTR-DF508 e alcune di esse sono in fase di sperimentazione clinica (le più più noto sono VX-809-Lumacaftor e VX-661); tuttavia c’è la necessità di identificare nuovi correttori, dal momento che i primi studi clinici con queste molecole hanno dato risultati piuttosto modesti, anche se incoraggianti su questa strada di ricerca.
Per scoprire le proteine che bloccano DF508 si può procedere in vari modi: alcuni gruppi di ricerca si sono orientati sull’uso di siRNA. L’interferenza da RNA è un meccanismo mediante il quale frammenti di RNA a doppio filamento (e in questo caso frammenti con sequenza breve di basi: siRNA = small interfering RNA =RNA interferente breve) sono in grado di interferire (e spegnere) l’attività di specifici geni. Con il progetto FC#5/2012, la dott. Nicoletta Pedemonte (Lab. Genetica Molecolare, Ist. “G. Gaslini”, Genova) si è già cimentata in questo campo, esplorando attraverso i siRNA di oltre 6000 geni (e altrettante proteine) e identificandone 4 importanti nell’attività di recupero di DF508. Per una di queste proteine, il recupero è stato controllato misurando l’attività di DF508 su di un modello animale.
Un gruppo di ricerca che opera a Toronto si dedica allo stesso tema e in questo articolo (1) illustra come abbia sottoposto a screening una libreria di siRNA che hanno per bersaglio circa 750 geni di altrettante differenti proteine (chinasi = proteine in grado di trasferire energia a specifici substrati). Hanno poi realizzato esperimenti volti a capire l’azione di queste proteine rispetto al processo di maturazione di CFTR-DF508.
Abbiamo chiesto alla dott. Pedemonte di illustrarci brevemente il lavoro dei colleghi di Toronto. Di seguito, quanto ci scrive.
“La mutazione DF508 determina difetti multipli a carico della proteina CFTR, che vengono rilevati da vari sistemi di “controllo qualità” presenti nelle cellule. L’efficacia dei correttori identificati fino ad oggi è parziale, e si ritiene che solo combinando farmaci con meccanismi diversi si possa ottenere un recupero di CFTR-DF508 che sia rilevante da un punto di vista terapeutico. Per sviluppare nuovi farmaci occorre una migliore comprensione dei processi cellulari che determinano il destino della proteina mutata. Il gruppo della dott.ssa Rotin (1) si è concentrato su un insieme di proteine, le chinasi, al fine di identificare proteine responsabili del blocco della maturazione di CFTR mutata. Attraverso l’uso combinato di molecole di RNA interferente (iRNA) e di inibitori farmacologici, gli autori hanno dimostrato che: 1) la via di segnalazione a valle del recettore per il fattore di crescita dei fibroblasti (FGFR) gioca un ruolo importante nella degradazione di CFTR DF508; 2) la sua inibizione determina un significativo aumento della maturazione e della funzione di DF508; 3) il trattamento combinato con il correttore VX-809 aumenta ulteriormente il recupero della DF508. Questi risultati, ottenuti su modelli sperimentali rilevanti (fra cui cellule delle vie aeree derivate da pazienti FC ma anche organoidi intestinali – in pratica una sorta di “mini-intestino – derivati da topi con genotipo DF508/DF508 omozigoti) supportano l’ipotesi che il recettore per FGF e la relativa via di segnalazione possano costituire bersagli farmacologici di nuovi interventi terapeutici per il trattamento della fibrosi cistica. Naturalmente, per stabilire l’importanza e la fattibilità della modulazione farmacologica di questa via c’è bisogno di ulteriori studi per chiarire, ad esempio, i possibili effetti negativi di una sua modulazione a lungo termine nei pazienti”.
1) Trzcinska-Daneluti AM, Chen A, Nguyen L et all “RNA interference screen to identify kinase that suppress rescue of Df508-CFTR” Mol Cell Proteomic 2015 Mar 29
