La mutazione più frequente in FC è la ΔF508: essa causa un difetto di maturazione della proteina CFTR, che viene distrutta prima di essere inserita nella membrana cellulare. Come terapia è stata indicato l’uso di composti denominati correttori, che evitano la distruzione della proteina ΔF508 mutata, permettendogli di arrivare in membrana ed esercitare la sua funzione di trasporto di cloro. E’ di fondamentale importanza conoscere la struttura molecolare di CFTR impiegando mezzi a risoluzione elevatissima (atomica), ma questo viene impedito da difficoltà tecniche che ostacolano la cristallizzazione (trasformazione in forma solida) della proteina. Questo progetto si propone di studiare la struttura molecolare della CFTR utilizzando metodi di diffusione di raggi−X a basso angolo (SAXS= small-angle X-ray scattering). Con questa tecnica è possibile avere informazione dettagliata sulla struttura molecolare della proteina in condizioni simili a quelle fisiologiche. L’obbiettivo è quello di mettere a punto un apposito protocollo per l’estrazione e purificazione di CFTR da cellule di mammiferi; quindi studiare con SAXS la struttura della CFTR normale in diversi stati funzionali e di confrontarla con la struttura della CFTR mutata; inoltre trattare (sempre su cellule di mammifero) CFTR mutata con correttori e indagare come questi farmaci ne modificano la conformazione molecolare. I risultati ottenuti serviranno a capire i meccanismi di funzionamento della CFTR normale e le alterazioni patologiche dovute alla mutazione ΔF508, inoltre ad acquisire informazioni che potrebbero essere fondamentali per lo sviluppo di nuovi e migliori correttori per la terapia farmacologica del difetto di base nella FC.
The most frequent mutation in CF, ΔF508, causes defects in the maturation of the protein, which is destroyed before being inserted into the cell membrane. As a therapy it has been indicated the use of compounds, known as correctors, that prevent the destruction of ΔF508, allowing it to reach the membrane and to carry out its Cl- transport function. The determination of the molecular structure of CFTR at atomic level is inhibited by many technical difficulties that prevent the crystallization of the protein. We propose to study the molecular structure of CFTR using methods of small-angle X-ray scattering (SAXS). With this technique, which has the advantage that does not need to apply any particular treatment of the sample, it is possible to have detailed information on the molecular structure of proteins under conditions similar to physiological ones. The goal is to study the structure of the normal CFTR in different functional states, and compare it with the structure of the protein carrying the mutation ΔF508. The CFTR, normal or mutated, will be purified from mammalian cells, which can also be treated with correctors in order to study how these drugs modify the molecular conformation of the mutant. Specific aims are: 1- To set-up a protocol for the purification of the whole CFTR from mammalian cells. 2- To determine the structure of solubilized and purified CFTR at medium resolution by SAXS. 3- To find out the conformational differences between wild-type and ΔF508 CFTR. 4- To study the effect of correctors on the ΔF508 CFTR conformation.
