Le mutazioni stop (chiamate anche “non senso”) introducono nella sequenza del DNA codoni (messaggi in codice) di interruzione prematura della sintesi proteica e sono la causa di circa il 30% delle malattie ereditarie, inclusa la fibrosi cistica (FC). Le mutazioni stop del gene CFTR provocano l’arresto della sintesi della proteina CFTR, che viene prodotta solo in frammenti di lunghezza variabile a seconda del punto in cui interviene l’arresto; questi frammenti vengono poi distrutti. Esiste un meccanismo di difesa cellulare, noto con il nome di “Decadimento di mRNA mediato dal non-senso” (NMD), mediante il quale le cellule tendono a degradare i frammenti di RNA che portano il messaggio per il blocco prematuro della sintesi. Negli ultimi anni, farmaci come gli antibiotici aminoglicosidici si sono dimostrati attivi nel sopprimere il blocco prematuro mediante un meccanismo detto read-through (“lettura dall’inizio alla fine” del codice genetico per quella proteina), che è in grado di mascherare il messaggio di blocco e riavviare la lettura completa dei codici che portano alla sintesi della proteina tutta intera. Questo progetto prevede di ottimizzare questa strategia utilizzando molecole che agiscono con meccanismo read-through in modelli cellulari sperimentali (cellule di lievito o linee cellulari umane ) contenenti mutazioni di stop per la fibrosi cistica. Scopo del progetto è identificare, attraverso screening di librerie chimiche e di aminoglicosidi già in commercio , nuovi composti ad azione read through. Inoltre saranno sviluppate strategie per modulare il meccanismo NMD e individuare la migliore combinazione di molecole read-through e modulatori NMD. Perciò questo studio può essere utile per lo sviluppo di un approccio farmacologico per la cura della fibrosi cistica causata da mutazioni stop.
Nonsense mutations promote premature translational termination and following loss of CFTR protein by introduction of premature termination codons (PTCs). The functional consequences of these mutations are minimized by the nonsense-mediated RNA decay pathway (NMD), a cellular mechanism, aimed to detect and degrade mRNA carrying PTCs. It has been demonstrated that drugs (like aminoglycoside antibiotics) can be designed and produced to suppress this process by the ribosomal read-through mechanism where these drugs mask PTC synthesizing a full length CFTR protein. We have found G418 aminoglycoside has an efficient read-through activity when NMD mechanism is abolished or not, while tobramycin is active only when NMD is abolished. These model systems can be used to monitor read-through at nonsense codons and to discriminate potential direct effects on the reporter gene products by NMD effectors. This project will study the development of: (a) HTS assays based on S. cerevisiae and human cell lines useful to identify novel molecules exhibiting enhanced read-through activity by screening of chemical libraries and commercial aminoglycosides; (b) experimental strategies to reduce NMD mechanism. The study may introduce new hopes for the development of a pharmacologic approach to the cure of CF.
