Salve, sono uno studente di biotecnologie mediche. Sto studiando la fibrosi cistica e vi chiedo quali tecniche diagnostiche si utilizzano per l’analisi genetica diretta di fibrosi cistica, sia se si tratti di una mutazione nota che di una non nota. Grazie.
Si distinguono in genere tre livelli di analisi molecolare, con diversi tempi di esecuzione,diverse tecnologie e diversi costi. Il primo livello è quello delle analisi più semplici. Diamo di seguito una loro breve sintesi. Per spiegazioni più approfondite consigliamo la lettura del documento “Modelli di Analisi Genetica per Fibrosi Cistica” (1), in cui viene descritta la tecnica e soprattutto dettagliata l’indicazione, cioè di ogni tecnica è specificato l’uso più appropriato.
Analisi di I livello: esistono dei kit messi a disposizione dal commercio o preparati in laboratorio che includono l’analisi delle mutazioni più frequenti nelle regioni di riferimento del laboratorio.
Le tecniche più utilizzate sono Revers Dot Blot, Amplification Refractory Mutation System, Oligonucleotide Specific Allele and Oligonucleotide Ligation Assay. Si usano questi kit se la mutazione da cercare è conosciuta e se si sa che è compresa nel pannello di mutazioni del kit.
In futuro il numero di mutazioni identificabili con un solo kit diagnostico è destinato ad essere sempre maggiore, perchè l’industria si sta occupando della preparazione di DNA-microarray o DNA chip utili a saggiare fino a 200 mutazioni del gene CFTR (2) .
Analisi di II livello: scanning di tutti gli esoni del gene e delle regioni limitrofe, con riconoscimento di variazioni di sequenza, oppure sequenziamento di una specifica regione del gene. Le tecniche più utilizzate sono Denaturing Gradient Gel Electrophoresis e Denaturing High Performance Liquid Cromatography. I test di II livello si usano quando la mutazione da identificare non è conosciuta: forniscono un elevato tasso di identificazione (detection rate) di variazioni della sequenza del gene, ma il significato “fenotipico” (cioè l’effetto in termini di sintomi ) di queste variazioni può essere di difficile interpretazione. Infatti, talora può essere difficile distinguere varianti “innocenti”, prive di effetto fenotipico, dalle mutazioni vere e proprie, che alterano la qualità o la quantità della proteina prodotta dal gene e quindi producono sintomi .
Analisi di III livello: ricerca di delezioni o inserzioni o duplicazioni della sequenza del gene. Si tratta di indagini molto specialistiche, di recente venute alla ribalta, anche perchè in grado di diagnosticare le mutazioni cosiddette da “riarrangiamento genetico”, che rappresentano una quota non trascurabile (si stima circa il 20%) delle mutazioni ancora sconosciute del gene CFTR.
M. Seia
Laboratorio Genetica Molecolare
Fondazione IRRCS Policlinico, Mangiagalli e Regina Elena, Milano
G. Borgo
1) “Modelli di Analisi Genetica per Fibrosi Cistica”, “www.pnlg.it “
2)”Screening del portatore FC: progressi tecnici verso un test ideale “, 01/09/05
