Nel corso del progetto, i ricercatori hanno realizzato 18 colture cellulari ex vivo, che sono state opportunamente validate e conservate a lungo termine in condizioni controllate. Queste colture, che si aggiungono alle 24 ottenute nel corso della precedente fase del progetto sono state ottenute a partire da cellule staminali epiteliali nasali riprogrammate isolate da pazienti con fibrosi cistica (FC) con diversi genotipi (omozigoti F508del; eterozigoti composti F508del/altra mutazione; genotipi rari privi della mutazione F508del) o di soggetti eterozigoti (portatori sani) e individui sani senza alcuna mutazione del gene CFTR. A partire da queste cellule staminali, i ricercatori hanno generato e validato modelli di fibrosi cistica che riproducono il tessuto patologico in vitro (air liquid interface o ALI-cultures e organoidi nasali). Su questi modelli cellulari, il gruppo di ricerca ha così messo a punto diversi test per la caratterizzazione biochimica e funzionale del CFTR dopo trattamento farmacologico per determinare la risposta delle diverse varianti genetiche (theratyping) a modulatori già approvati come Kalydeco, Orkambi, Symkevi e Kaftrio. Dagli studi è emerso che i modelli e i test messi a punto dai ricercatori mostrano una generale bassissima attività di Kalydeco, Orkambi e Symkevi, e una marcata risposta a Kaftrio in tre genotipi con la mutazione F508del associata ad altre mutazioni, in particolare quelle che determinano lunghe inserzioni nucleotidiche.
È stata anche valutata la risposta a Kaftrio di altre varianti genetiche rare di malattia (prive della mutazione F508del): i risultati più promettenti sono stati ottenuti per la variante L1077P del gene CFTR.
Questi modelli cellulari, basati sulle cellule condizionalmente riprogrammate, si sono mostrati particolarmente preziosi per il theratyping ex vivo e potrebbero contribuire a miglioramenti terapeutici, con indubbi benefici anche per i pazienti con varianti rare di CFTR, tuttora privi di terapie mirate approvate.
Results of the 1-year project FFC#8/2020 (extension of a previous project) consisting in ex vivo expansion, validation and biobanking of 18 long-term cultures of reprogrammed epithelial nasal stem cells (to be added to the 24 banked during the first part of the project). The researchers report that these cells have been obtained from nasal brushings of Cystic Fibrosis (CF) patients with various genotypes (F508del homozygous, compound heterozygous F508del/other, rare genotypes lacking F508del allele), as well as of heterozygotes/carriers and healthy individuals with no CFTR mutation. Based on these stem cells, the research team generated and validated CF models that reproduce the pathologic tissue ex vivo as air liquid interface cultures (ALI-cultures) and nasal organoids. Different assays have been generated and optimized based on these models for the biochemical and functional characterization of CFTR, basal/residual and after pharmacological treatment, to determine the response of different genetic variants (theratyping) to modulators already approved for other variants (Kalydeco, Orkambi, Symkevi, Kaftrio). In particular, a biochemical assay to detect and quantify the corrected CFTR protein in immunoblot, the forskolin-induced swelling of organoids and the fluid re-absorption assay in ALI-cultures to assess and quantify the ability of CFTR modulators to restore CFTR correct protein folding and maturation and function, were applied. These models and assays allowed to demonstrate a general scarce activity of Kalydeco, Orkambi and Symkevi, while a marked Kaftrio response was observed in three heterozygous compound genotypes carrying F508del associated on the second allele to a mutation determining large nucleotide insertions.
Kaftrio response has been evaluated also in rare genetic variants of disease (lacking F508del mutation) with the most promising results for the L1077P CFTR variant.
These cellular models, based on conditionally reprogrammed cells, proved highly precious for theratyping ex vivo and may contribute to therapeutic improvement with clear benefit also for patients with rare variants of CFTR, still lacking approved targeted therapies.
