Recensione di pubblicazione da progetto FFC
Toward a Rationale for the PTC124 (Ataluren) Promoted Readthrough of Premature Stop Codons: a Computational Approach and GFP-Reporter Cell-Based Assay
Laura Lentini, Raffaella Melfi, Aldo Di Leonardo, Angelo Spinello, Giampaolo Barone, Andrea Pace, Antonio Palumbo Piccionello, and Ivana Pibiri. Mol. Pharmaceutics, 2014, 11 (3), pp 653-664
Le mutazioni del gene CFTR chiamate nonsenso (o stop) bloccano prematuramente la sintesi della proteina. Ataluren o PTC124, è una piccola molecola in grado di ripristinare la sintesi della proteina ed è in fase di avanzata sperimentazione clinica, anche se i risultati preliminari appaiono piuttosto modesti. Alcuni aspetti del meccanismo di funzionamento di questo farmaco non sono ancora completamente conosciuti e altri, in base alle conoscenze acquisite, appaiono migliorabili. All’interno del progetto FFC#2/2011 i ricercatori hanno analizzato in dettaglio il funzionamento della molecola Ataluren.
Ataluren (PTC124) è nato come farmaco capace di correggere l’effetto delle mutazioni stop (o nonsenso). Queste mutazioni interrompono prematuramente la sintesi della proteina CFTR e Ataluren ha dimostrato in studi in vitro la sua attitudine a ripristinare in tutto o in parte la sintesi della proteina bloccando il segnale di stop. Il meccanismo di funzionamento della molecola è, tuttavia, ancora molto dibattuto. Il lavoro qui presentato è frutto del progetto di ricerca FFC#2/2011, finalizzato proprio allo studio delle molecole che ripristinano la sintesi di CFTR interrotta da mutazioni stop e in particolare della molecola Ataluren, o PTC124, al fine di proporre un modello che permetta di descrivere nei dettagli il suo funzionamento .
I ricercatori hanno isolato linee cellulari umane capaci di mostrare gli effetti di un particolare gene: H2B-GFP, composto da frammenti di DNA di diversi geni. H2B-GFP porta alla sintesi di GFP, una proteina fluorescente di colore verde. Il gene H2B-GFP è stato studiato nella sua forma normale e nella forma mutata per effetto dell’inserimento di un segnale di stop. Gli esperimenti condotti hanno permesso di vedere che, se il segnale di stop funziona, la proteina non viene sintetizzata completamente e non risulta essere verde; mentre se il segnale di stop viene soppresso con successo da Ataluren, la proteina risulterà verde (si veda figura). In buona sostanza si tratta di un modello fluorescente che permette di valutare l’efficacia di Ataluren sui segnali di stop.
A questo studio in vitro è stata accompagnata una simulazione al calcolatore (con tecnica chiamata MD: molecular dynamics) per identificare il bersaglio esatto dell’azione di Ataluren, che rimane ancora sconosciuto. Questa tecnica ha portato all’identificazione di una specifica corrispondenza fra Ataluren e il tratto di RNA messaggero della mutazione CFTR contenente il segnale di stop. In questo modo viene proposta una ragionevole interpretazione della specificità/selettività di PTC124 per i segnali di stop. Anche se i risultati MD rappresentano un modello semplificato delle interazioni mRNA/PTC124, i dati ottenuti potrebbero essere un punto di partenza utile per gli studi computazionali del comportamento di PTC124 in sistemi molto più complessi.
La possibilità di simulare interazioni farmaco-bersaglio a livello molecolare, in combinazione con test di biologia sperimentale (proteina fluorescente), è molto promettente come approccio sinergico verso la definizione del meccanismo d’azione di PTC124.
The presence in the mRNA of premature stop codons (PTCs) results in protein truncation responsible for several inherited (genetic) diseases. A well-known example of these diseases is cystic fibrosis (CF), where approximately 10% (worldwide) of patients have nonsense mutations in the CF transmembrane regulator (CFTR) gene. PTC124, also known as Ataluren, is a small molecule that has been suggested to allow PTC readthrough even though its target has yet to be identified.
In this paper the author tested the ability of PTC124 to promote the readthrough of premature termination codons by using a new reporter. The reporter vector was based on a plasmid harboring the H2B histone coding sequence fused in frame with the green fluorescent protein (GFP).
To assess the in vitro ability of PTC124 to promote nonsense mutation suppression, the authors isolated human cell lines stably expressing the H2B-GFP chimeric gene, either wild-type (control) or mutated by the presence of a premature stop codon. Results support the hypothesis that PTC124 is able to promote the readthrough of the internal premature stop codon, rather than simply stabilize proteins structures.
In addition to that, the authors simulated drug-target interactions at the molecular level, aiming at identifying the actual PTC124’s biological target, which is still a challenging goal. This computational approach has been used for the first time to study mRNA as a putative target for PTC124 and to propose a reasonable interpretation of PTC124’s specificity/selectivity toward a given UGA codon. Even if these MD results represent a simplified model of the mRNA/PTC124 interactions in aqueous media, those data would be a useful starting point for computational studies of PTC124’s behavior in much more complex systems. The proposed methods represent a very promising synergic approach toward the definition of PTC124’s mechanism of action.
