Qual è il problema
In molti paesi d’Europa operano centri esperti nelle tecniche di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA) e Diagnosi Genetica Preimpianto (PGD). In Italia, dopo che nel 2004 è andata in vigore la Legge 40, c’è stato un rallentamento generale delle attività scientifiche in questo campo, così pure l’impedimento all’accesso alla PMA alle coppie portatrici di FC. Si spera che in base all’evoluzione delle norme della Legge tutto questo sia destinato a cambiare.
Che cosa si sa
Si sa che la PMA è una procedura a cui le coppie FC fanno ricorso avendo come motivazione principale quella di poter avviare una gravidanza già diagnosticata (su pre-embrione) priva di malattia FC; e di evitare in questo modo l’esperienza traumatica dell’interruzione di gravidanza dopo diagnosi di malattia fatta con villocentesi (terzo mese di gravidanza) o amniocentesi (quinto mese).
Che cosa aggiunge questo studio
Presso il centro di Montpellier la FC è la malattia genetica più frequentemente richiesta di PGD. La legislazione francese è molto chiara: accedono alla PGD solo coppie portatrici di mutazioni CFTR causanti forme “classiche” di malattia. Il centro ha messo a punto un ottimo percorso di indagini genetico-molecolari per evitare il rischio di errori diagnostici. Può dimostrare buoni risultati finali con elevato tasso di successo (valutato come % di gravidanza ottenuta rispetto ad ogni procedimento di trasferimento di embrioni): 38.3% nelle coppie di portatori FC (inclusi 6 soggetti con CBAVD) e 30.8% nelle coppie in cui uno dei due è affetto da FC (6 maschi e 4 femmine).
PREMESSE
Tecniche e protocolli per la realizzazione della PGD sono migliorati nel corso degli anni: la difficoltà di fondo rimane la quantità estremamente ridotta di DNA disponibile per l’analisi genetica e i tempi molto stretti per realizzarla, dal momento che l’embrione diagnosticato non affetto deve essere trasferito nell’utero materno entro 24 ore dalla diagnosi, per aumentare le probabilità di impianto. Ci sono poi cause di errori diagnostici che vanno attentamente prevenute, come il fenomeno chiamato ADO (Allele Drop Out, praticamente il non riuscire a “vedere” con la tecnica il contributo genetico di uno due genitori) e la contaminazione del DNA in esame con materiale genetico estraneo. In Francia la PGD è realizzata in soli 4 centri universitari ed è strettamente regolata, essendo riservata alle coppie “che hanno alta probabilità di avere un bambino affetto da malattia genetica particolarmente severa e riconosciuta come incurabile al momento della richiesta”. Solo le coppie portatrici di mutazioni FC certamente patologiche possono quindi accedere alla PGD. E inoltre “le coppie FC sanno che possono essere trasferiti non solo embrioni sani (= non FC), ma anche portatori sani di una mutazione del gene”. Sul piano tecnico il centro di Montpellier ha migliorato il protocollo per l’analisi genetica del gene CFTR su singola cellula e riporta l’esperienza di più di 10 anni di attività, descrivendo il percorso e l’esito di 114 cicli di PGD.
MATERIALE E METODI
Nel periodo gennaio 2004-Febbraio 2014 hanno fatto richiesta di PGD per FC al centro di Montpellier 142 coppie. Di queste solo 128 (90%) sono risultate avere i criteri utili per l’avvio della procedura: nelle altre un partner della coppia risultava portatore di una mutazione/variante non causante malattia e la PGD non è stata ritenuta indicata. 76 di 128 sono entrate nella procedura del ciclo per PGD. Questa prevede come primo step le indagini genetiche: 59 su 76 (77%) erano coppie di portatori FC; 36 di loro avevano avuto un figlio affetto, 13 avevano interrotto una gravidanza con intestino iperecogeno e successiva diagnosi di FC, 10 erano coppie di portatori identificate attraverso screening del portatore con sistema “a cascata” (cioè a partire da un familiare affetto).
In altre 17 coppie (22% del totale) un partner era FC (6 maschi, 4 femmine) o CBAVD (7 maschi) e il partner era portatore di una mutazione FC. Le indagini genetiche hanno previsto la ricerca, oltre che naturalmente delle mutazioni FC, anche dell’informatività genetica attraverso 8 marcatori intragenici. Dopo le indagini genetiche e quelle di inquadramento per l’apparato riproduttivo, le coppie hanno ricevuto informazione completa sulla procedura da un team composto da un genetista clinico, un esperto di embriologia, un ginecologo e l’infermiera di coordinamento. Gli spermatozoi utilizzati per la fertilizzazione dell’ovocita sono stati ottenuti da liquido seminale o da prelievo testicolare nei soggetti CBAVD. La fertilizzazione dell’ovocita attraverso spermatozoo è stata realizzata tramite tecnica ICSI. Dall’embrione in stadio di sviluppo di terza giornata (composto di 6 cellule) è stata prelevata una singola cellula per l’indagine genetica (2 cellule se l’embrione era composto di 7 cellule). Uno o due (eccezionalmente 3) embrioni sono stati trasferiti in quarta giornata dopo la fertilizzazione. A partire dal marzo 2012 gli embrioni sovrannumerari sono stati criocongelati. L’impianto dell’embrione è stato confermato attraverso controllo dell’elevazione dell’ormone βHCG ai giorni 11, 13, 15 dopo il trasferimento in utero, e del rilevamento del battito fetale cinque settimane dopo.
RISULTATI
Al momento della stesura della ricerca, 53 delle 76 coppie incluse hanno realizzato l’intero ciclo di PGD. In media si è trattato di un paio di cicli per coppia: 114 cicli di PGD complessivi. Sono stati raccolti 1164 ovociti e 905 sono stati fertilizzati con un singolo spermatozoo. 604 sono risultati fertilizzati e hanno prodotto 493 embrioni di qualità sufficiente per essere sottoposti a biopsia di una cellula al terzo giorno di sviluppo. L’analisi genetica ha diagnosticato che 262 di 493 erano normali (non FC) o portatori FC, mentre 112 erano FC, 30 non hanno avuto una diagnosi per problemi di tecnica genetica (impossibile l’amplificazione del DNA), in altri 90 il sospetto di aneuploidie (alterazioni del numero dei cromosomi). Dei 262 trasferibili ne sono stati realmente trasferiti 75. Un solo embrione nel 32% dei casi, due nel 60% e tre nell’8% dei casi. Nelle donne FC naturalmente un solo embrione.
In definitiva, in 53 coppie uno o più cicli di PGD sono andati a buon fine, essendosi verificate 28 gravidanze, con un tasso di successo (calcolato come gravidanza per numero di cicli con trasferimento in utero di embrioni) del 38.3% nelle coppie di portatori FC, e del 30.8% nelle coppie in cui un soggetto era affetto da FC. Da segnalare un aborto spontaneo alla 12a settimana di gravidanza in un caso. Villocentesi o amniocentesi precoce è stata raccomandata in tutte le gravidanze: vi è stata un’interruzione volontaria di gravidanza dopo che la villocentesi aveva diagnosticato un’anomalia cromosomica (delezione parziale del cromosoma 18); un’altra interruzione selettiva è stata praticata dopo diagnosi di grave malformazione in un gemello. Ad oggi sono nati 25 bambini, tutti negativi allo screening neonatale per FC.
COMMENTO
Circa il 15% del totale delle richieste di PGD a questo centro sono per FC, cosa che fa della FC la più comune delle indicazioni per PGD, per lo meno a Montpellier. Ma anche i dati europei (2) indicano che FC è la seconda richiesta più frequente, seconda solo dopo la microcitemia (fra le malattie autosomiche recessive) e seconda anche fra tutte le malattie monogeniche. Il protocollo diagnostico messo a punto sembra altamente affidabile dal momento che ha permesso la diagnosi (con utilizzo prevalente di una sola cellula embrionaria!) in 463 su 493 embrioni. Le mutazioni più comuni sono state DF508 in entrambi i partner nel 47.7% dei casi, in uno solo nel 37%. Altre mutazioni frequenti G542X, N1303K, 2789+5G>A. Interessante notare che sono stati trasferiti 14 embrioni “eterozigoti composti”: il genotipo era composto da una mutazione FC “certa” e un’altra mutazione non causante malattia (es: DF508 su di un cromosoma e l’allele 5T sull’altro) e 4 embrioni con genotipo DF508 e R117H-7T. Questi genotipi possono essere associati ad una gamma molto varia di situazioni: da completa assenza di sintomi a malattia CFTR correlata, a quadro localizzato di CBAVD. Ma la valutazione dell’ equipe del centro e della legge francese è che queste caratteristiche genetiche non sono così rischiose da rendere legittimo da parte della coppia rifiutare l’impianto dell’embrione. Il ragionamento favorevole all’impianto di questi embrioni è, secondo gli esperti francesi, che il rischio di penetranza (vale a dire manifestazione di sintomi) è molto basso, per esempio per il genotipo DF508/ R117H-7T è stimato dello 0.03% per una forma di FC classica e 0.06% per una FC ad esordio tardivo.
1) Girardet A, Ishmukhametova A, Willems M, Claustres M. “Preimplantation Genetic Diagnosis for Cystic Fibrosis :the Montpellier centre’s 10-year experience” Clin Genet. 2014 Apr 25. doi: 10.1111/cge.12411. [Epub ahead of print]PMID:24762087
2) Goossens V et al. “ESHRE PGD Consortium data collection XI: Cycles from January to December 2008 with pregnancy follow up to October 2009”. Hum Reprod 2012:27:1887- 1911
