Ricercatori dall’Oregon Health and Science University (USA) hanno impiegato la nuova tecnica Crispr-Cas9 per correggere il gene responsabile di una grave malattia cardiaca. La notizia ha suscitato grande scalpore perché i ricercatori hanno lavorato sul DNA dello zigote, la singola cellula derivante dalla fusione di ovocita e spermatozoo che dà avvio allo sviluppo dell’embrione. Le prove successive per controllare l’efficacia del trattamento si sono svolte su embrioni allo stadio di 8 cellule di sviluppo (terza giornata dalla fertilizzazione dell’ovocita). Abbiamo esaminato l’articolo scientifico pubblicato sulla rivista Nature (1) e descriviamo qui gli esperimenti condotti, con la consapevolezza che comunque la loro comprensione può presentare non pochi ostacoli.
Il metodo CRISPR/Cas9 è stato chiamato anche la “forbice molecolare” perché è basato sulla scoperta di meccanismi molecolari di taglio e riparazione del DNA. Cas9 è una nucleasi, cioè una proteina che taglia il DNA; utilizzando delle opportune molecole di RNA come guida, Cas9 può essere indirizzata verso punti precisi del genoma cellulare, ad esempio in corrispondenza di una mutazione del gene CFTR. Avvenuto il taglio, le cellule effettuano una riparazione che, in presenza di un opportuno DNA stampo, può portare all’eliminazione definitiva della mutazione e al ripristino della sequenza normale del gene in questione. Nel caso del gene CFTR, sono già pubblicati studi in cui, utilizzando come vettore del sistema CRISPR/Cas9 un virus del gruppo dei Lentivirus, è stata realizzata la riparazione del gene CFTR in vitro su cellule epiteliali respiratorie e su organoidi intestinali. L’ostacolo principale alla riparazione in vivo è il non aver ancora individuato il vettore più adatto alla diffusione di CRISP/cas9 nel maggior numero di cellule che costituiscono il tessuto o l’organo da trattare. Nonostante l’obiettivo sia molto difficile, sono state investite risorse imponenti per applicare il gene editing (così si chiama questa ristrutturazione del gene mutato) alla FC e ad altre malattie ereditarie (2).
Negli esperimenti dello studio su cellule embrionali che qui commentiamo, il gene mutato in questione è responsabile della cardiomiopatia ipertrofica, una malattia genetica del muscolo cardiaco che interessa una persona su 500 e può causare tra l’altro la morte improvvisa degli atleti. Il gene si chiama MYBPC3, si trova sul cromosoma 11 e codifica le proteine contrattili costitutive del muscolo cardiaco. La mutazione di MYBPC3 viene trasmessa con modalità autosomica dominante, cioè vi è il rischio del 50% di ereditarla da un genitore affetto. Non tutte le persone che hanno la mutazione sviluppano la malattia (penetranza variabile) e la malattia può manifestarsi a età diverse e con diversi gradi di gravità e di evoluzione (espressione variabile). Se un genitore ha la cardiomiopatia ipertrofica dovuta a questa mutazione, in caso di gravidanza è possibile fare la diagnosi prenatale (in epoca precoce di gravidanza) e la diagnosi genetica preimpianto (su embrioni ottenuti attraverso procreazione medicalmente assistita). Lo studio si è appunto svolto su cellule di embrioni con mutazione del gene MYBPC3: la correzione della mutazione potrebbe, come primo risultato, aumentare il numero di embrioni privi della mutazione, trasferibili in utero per possibile gravidanza. Lo studio in questione si svolge principalmente i 5 direzioni.
Prima dello studio su embrioni, saggio di efficienza e specificità di CRISPR/Cas9 in cellule staminali (IPSCs) del paziente con mutazione del gene MYBPC3
Allo scopo di ricorrere alle cellule embrionali solo quando il sistema fosse ben collaudato, i ricercatori hanno compiuto una sorta di prova generale lavorando su di un particolare tipo di cellule staminali del paziente (cellule IPSCs). Le cellule staminali sono state scelte perché già usate in altri campi per tecniche di correzione genetica: qui l’esperimento mirava a conoscere la possibilità di transfezione del sistema, cioè la possibilità di far penetrare nelle cellule il sistema CRISPR/Cas9 e il suo RNA guida, mediante un particolare metodo fisico (elettroporazione, basata sulla creazione di una differenza di potenziale fra cellula e materiale da inserire).
La transfezione non è avvenuta nella maggior parte delle cellule IPSCs trattate, infatti la mutazione è rimasta presente nel 72% delle cellule; il taglio del tratto di DNA mutato è invece avvenuto nel 27%. Al taglio deve far seguito la riparazione con inserimento della sequenza normale: il DNA può provvedere alla sua riparazione attraverso un meccanismo detto NHEJ (Giunzione Finale Non Omologa) che è però inappropriato in quanto spesso causa di ulteriori mutazioni, per inserimento o delezione di tratti di DNA. È più conveniente il sistema HDR (Riparazione Diretta Omologa), che ricostruisce il filamento di DNA usando come stampo la copia del corrispondente cromosoma non mutato che deriva dall’altro genitore o un tratto di DNA esterno (esogeno). Visto il modesto risultato e il rischio di una riparazione scorretta, i ricercatori, modificando in una maniera particolare l’enzima che taglia (diventa Cas9-1), hanno ottenuto che il DNA fosse riparato prevalentemente attraverso HDR. Alla fine dell’esperimento hanno dimostrato una modesta efficienza del sistema (è penetrato e ha riparato il DNA nel 27% delle cellule mutate). Molto buona invece la specificità: CRISPR/Cas9-1 taglia solo là dove deve tagliare, nessuna cellula staminale con gene MYBPC3 normale è stata presa di mira.
Dimostrazione di efficienza del sistema in zigoti umani
Lo zigote è la cellula prodotta dalla fusione dello spermatozoo con l’ovocita: utilizzando spermatozoi del soggetto malato e ovociti di donatrice sana sono stati prodotti zigoti il cui sviluppo è proseguito fino allo stadio embrionale di 8 cellule. È stata fatta l’analisi del DNA di queste cellule, che è servita a confermare che la mutazione genetica si era ripartita secondo il meccanismo ereditario previsto: su 19 embrioni 9 erano sani (mutazione genetica assente) e 10 (52%) avevano la mutazione genetica. A questo punto si passa alla sperimentazione vera e propria in zigoti umani: si introduce nello zigote, mediante microiniezione, l’RNA guida e CRISPR/cas9-1. Non c’è quindi il problema del vettore, è sufficiente la microiniezione. Gli zigoti progrediscono fino allo stadio di sviluppo di 8 cellule. Attraverso tecnica di imaging si dimostra che il complesso è entrato. Si ottengono 54 embrioni (sempre composti da 8 cellule): 36 (66%) non hanno la mutazione (sono omozigoti sani), 18 (33%) hanno una copia della mutazione oppure sono “mosaici” (rispettivamente 5 e 13). Mosaicismo significa un corredo genetico composto contemporaneamente da due o più linee genetiche diverse, fenomeno che nello sviluppo successivo può essere causa di patologia. Secondo i ricercatori l’esperimento ha un discreto successo perché gli embrioni sani attesi dovevano essere il 50%, risultano invece, per effetto di CRISPr/cas9-1, il 66%; inoltre il meccanismo di riparazione usato dopo il taglio della mutazione è stato nella maggior parte dei casi L’HDR, quello più favorevole e fonte di meno errori, con utilizzo dello stampo del DNA materno. L’obiettivo successivo è quindi cercare di ovviare al problema del mosaicismo presente in molti zigoti.
Agire sui gameti (ovocita e spermatozoo) prima della formazione dello zigote, per eliminare il mosaicismo
Agendo per ipotesi basate sulla conoscenza finissima dei processi a cui va incontro il DNA dei gameti prima di dare origine allo zigote, i ricercatori scoprono che se iniettano CRISPr/cas9-1 in una particolare fase dell’ovocita (Fase M, quando l’ovocita si sta attivando per la fusione con lo spermatozoo, ma questo è ancora esterno alla cellula), la riparazione può essere indirizzata solo alla singola mutazione presente nel DNA dello spermatozoo. In pratica, restringendo il bersaglio, è meno facile che insorgano errori molecolari. Così infatti avviene e la percentuale di zigoti privi della mutazione patogena, invece che risultare il 50%, come atteso in base alle leggi della genetica, sale al 72%: 42 embrioni su 58 usati. Nel precedente esperimento la correzione aveva interessato il 66% degli embrioni. Inoltre la riparazione avviene prevalentemente secondo il meccanismo favorevole HDR (riparazione diretta omologa) di ispirazione materna.
Controllo dello sviluppo e del corredo cromosomico degli embrioni derivati da zigoti riparati
Per indagare se la correzione della mutazione attraverso CRISPR/Cas9-1 determina effetti sfavorevoli sullo sviluppo dell’embrione, una quota di quelli trattati viene fatta crescere fino allo stadio di blastocisti (circa 100 cellule, 5 giorni dalla fertilizzazione dell’ovocita). Non si evidenziano alterazioni del numero e della forma dei cromosomi.
Controllo dell’intero genoma e dell’esoma degli embrioni derivati da zigoti riparati
Vengono sottoposti ad analisi genetica approfondita (Whole Genome Sequencing di tutto il DNA codificante) prima il DNA del paziente, poi le cellule staminali IPSCs usate per il primo esperimento, infine gli embrioni trattati. Non emergono alterazioni nella sequenza del DNA, in particolare non ci sono le temute mutazioni “in/del” considerate un effetto fuori target della riparazione. Fatta anche analisi dell’esoma, cioè di tutto il DNA della cellula e quindi non solo quello codificante, con WES (Whole Exome Sequencing) non vengono segnalate alterazioni. Si conferma l’alta specificità del sistema.
Commenti
Normalmente, le probabilità che ha un embrione di ereditare la copia normale del gene dal genitore affetto da cardiomiopatia ipertrofica sarebbero state del 50%. L’intervento di CRISPR/Cas9 ha portato questa percentuale al 72% (42 embrioni sui 58 usati), eliminando e riparando il DNA con la mutazione in un ulteriore 22%. Ma l’obiettivo è la correzione del 100% degli embrioni. La strada da fare quindi è ancora lunga. L’intero studio è però la prova della possibilità di intervenire sullo zigote umano, la cellula che darà l’avvio allo sviluppo dell’embrione, e anzi colpisce quanto in profondità si conoscano oggi i meccanismi alla base della riproduzione umana e quanto fini siano gli interventi che si possono operare. Tuttavia sembra di capire che ancora parecchia strada ci sia da percorrere prima che la tecnica CRISPR/Cas9 possa trovare con efficacia e sicurezza applicazione nella correzione a livello prembrionale dei difetti genetici di molte malattie, fibrosi cistica compresa.
1) Ma H, Marti-Gutierrez N, Park SW et Al. “Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos” Nature 2017 Aug 24;548(7668):413-419. doi: 10.1038/nature23305. Epub 2017 Aug 2.
2) Galietta L, Panorama degli studi per terapie del difetto di base della fibrosi cistica. Seminario FFC Primavera 2017, pag. 16
