Salve, tempo fa rispondeste a delle domande sulle mutazioni splicing e le nuove terapie (Nuovi farmaci in sperimentazione e mutazioni CFTR). Ultimamente ho visto che avete affrontato di nuovo questo tema, stavolta togliendo ogni (ragionevole) dubbio sulla potenzialità del VX-770 sulle mutazioni di classe V. In effetti le autorità per l’approvazione del farmaco avevano richiesto diversi trial clinici, anche su mutazioni differenti dalla classe III, specialmente le classi IV e V. Ma ad un certo punto la Vertex ha deciso di cambiare le strategie escludendo quindi la mutazione 2789+5G->A (magari il motivo è sulla proteina, però non viene divulgato?) A questo punto mi chiedo, esistono screening di ampie classi di sostanze, per cercare dei potenziatori di splicing anche per queste mutazioni? Sarà avviato uno studio in Italia solo per queste mutazioni, magari utilizzando Denufosol, Moli1901 o altri composti? Ed infine, la ricerca sugli oligonucleotidi antisenso si è definitivamente arenata? Vi ringrazio in anticipo, il lavoro che fate ogni giorno vi fa onore e ci aiuta tantissimo.
Il problema posto appare dunque quello di eventuali studi relativi a farmaci che agiscano sulle mutazioni splicing del gene CFTR.
Innanzitutto, cosa sono le mutazioni splicing? Sono mutazioni che vanno a turbare il meccanismo per cui i pezzi codificanti del DNA genico vengono copiati a livello di mRNA, meccanismo chiamato appunto di splicing (montaggio). I pezzi codificanti del gene sono chiamati esoni e tra essi sono intercalati altri pezzi , non contenenti informazioni per la sintesi della proteina, chiamati introni. Di questi ultimi ancora poco si conosce ma certamente hanno, tra l’altro, funzioni di regolazione dello splicing. Solo gli esoni servono a formare il rispettivo mRNA, cui spetta avviare la sintesi della proteina CFTR. Quindi, il processo di splicing è una specie di operazione “taglia e incolla”, per il quale vengono ritagliati gli esoni da DNA e incollati in sequenza a formare mRNA. Le mutazioni splicing sono per la maggior parte collocate a livello di introni (ma non solo): esse impediscono in tutto o in parte il meccanismo corretto di splicing. Alcune di queste consentono una parte di giusto splicing e pertanto la sintesi di un certa quota di CFTR normale. La quota di splicing aberrante (in genere con l’inclusione di un nuovo esone o con la perdita di un esone) fa produrre invece una proteina abnorme che la cellula non utilizza. Dalla proporzione tra quantità di CFTR normale e CFTR aberrante deriva la maggiore o minore gravità dell’azione patologica esercitata dalla singola mutazione. La mutazione splicing 2789+5G>A è una di quelle che consentono la sintesi di una certa quota di CFTR normale: infatti essa si accompagna di solito ad una forma lieve di malattia (non vi è di solito insufficienza pancreatica).
I farmaci potenziatori della proteina CFTR (prototipo il VX-770) agiscono su CFTR difettosa ma presente sulla membrana apicale della cellula, rinforzandone l’azione di secrezione del cloro: sono in causa le mutazioni di classe III e IV, perché la proteina CFTR da esse mutata riesce ad arrivare sulla membrana apicale (per ora abbiamo risultati solo su pazienti con mutazione G552D, di classe III). Potrebbero agire anche su mutazioni di classe II (tipicamente la DF508) qualora la proteina da queste dipendente venisse aiutata a maturare e raggiungere quindi la membrana apicale (a questo punto funzionerebbe come una mutazione di classe III). Dei prodotti derivati da mutazioni che turbano lo splicing, ma consentono la sintesi di una piccola quota di CFTR normale (mutazioni di classe V), avremo a disposizione solo questa quota minima di proteina normale, mentre la parte aberrante non è disponibile. Probabilmente anche la CFTR normale può essere potenziata ma improbabilmente è immaginabile una compensazione utile, anche perché è molto poca. È la ragione per cui immaginiamo che i potenziatori, almeno così come oggi sono conosciuti, non abbiano grande spazio per medicare le situazioni patologiche determinate da mutazioni di classe V. Per queste non mancano tentativi di individuare mezzi correttivi. Soprattutto vi sono vari tentativi, intervenendo sui cosiddetti fattori di splicing, cioè sostanze in grado di modulare lo splicing in vario modo e varia misura. In altre patologie (es. distrofia muscolare, alcune talassemie, neurofibromatosi di Recklinghausen, alcune forme di cancro, etc. 1, 2), vi sono già tentativi in questa direzione: si tratterebbe di influenzare lo splicing sollecitando quello normale e abolendo, almeno in parte, lo splicing alternativo aberrante.
Molti fattori di splicing sono prodotti naturalmente dalle cellule dell’organismo (ma anche da virus). Si sono anche prodotti fattori sintetici. Tra questi, gli oligonucleotidi antisenso. Si tratta di corti filamenti che riproducono un tratto (una sequenza) del DNA o del RNA (20-25 basi, le stesse che costituiscono il DNA e l’RNA naturale) interessato dalla mutazione: questi possono legarsi a quel tratto modulando in senso correttivo lo splicing, abolendo quindi o limitando lo splicing aberrante. Non mancano alcuni tentativi di modulare lo splicing, al momento molto preliminari, anche nel campo FC, soprattutto per merito del gruppo israeliano di Batsheva Kerem (3, 4, 5) e di quello italiano di Franco Pagani presso l’ICGEB di Trieste (6), con finanziamenti della Fondazione Ricerca FC (Progetto FFC#9/2009: “Molecular pathology of the pre-mRNA splicing machinery in cystic fibrosis: mechanistic aspects and therapeutic approaches”). Vedremo in seguito gli sviluppi di questi approcci.
Sul tema si veda anche la domanda-risposta del 25.04.10: Nuovi farmaci in sperimentazione e mutazioni CFTR.
Per la parte di domanda che riguarda Denufosol e Moli1901, va precisato che questi farmaci, già in sperimentazione sul malato, non agiscono su mutazioni CFTR ma sono attivi su canali alternativi del cloro, con la possibilità di ottenere secrezione di cloro e quindi idratazione delle secrezioni attraverso canali secondari diversi dal canale CFTR.
1. Pros E, et al. Antisense therapeutics for neurofibromatosis type 1 caused by deep intronic mutations. Hum Mutat. 2009;30:454-62
2. El-Beshlawi A, et al. Correction of aberrant pre-mRNA splicing by antisense ologonucleotides in beta-thalassemia Egyptian patients with IVSI-110 mutation. J Pediatr Hematol Onco. 2008;30:281-4
3. Nissim-Rafinia M, et al.Cellular and viral splicing factors can modify the splicing pattern of CFTR transcripts carrying splicing mutations. Hum Mol Genet. 2000;9:1771-8
4. Nissim-Rafinia M, et al. Restoration of the cystic fibrosis trans membrane conductance regulator function by splicing modulation. EMBO Rep. 2004;5:1071-7
5. Nissim-Rafinia M, Kerem B. Splicing modulation as a modifier of the CFTR function. Prg Mol Subcell Biol. 2006;44:233-54
6. Dujardin G, et al. CELF proteins regulate CFTR pre-mRNA splicing: essential role of the divergent domain of ETR-3. Nucleic Acids Res. 2010 Jul 14 (Epub).
